一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體snj1的鑒定方法
【專利摘要】一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJ1的鑒定方法，該方法先將待檢測嗜鹽古生菌涂布在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7d以形成單菌落，再將單菌落接種至上層含有指示菌的雙層平板上恒溫培養(yǎng)2d，最后觀察雙層平板上是否形成噬菌斑。本發(fā)明無需對單菌落進(jìn)行增殖培養(yǎng)并使噬菌體與宿主細(xì)胞分離即可對噬菌體進(jìn)行鑒定，不僅縮短了鑒定周期，而且簡化了鑒定步驟，降低了成本。
【專利說明】一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJ1的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種噬菌體的鑒定方法，具體涉及一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，適用于縮短鑒定周期、簡化鑒定工序、降低成本。
【背景技術(shù)】
[0002]嗜鹽古生菌生活在高鹽(1.5~5M)的環(huán)境中，包括一些鹽湖和鹽廠，在一些鹽濃度接近飽和(約為35%w/v)的環(huán)境中，嗜鹽古生菌依然以較高的密度存在(約為108cell/
ml).
[0003]噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒的總稱，作為病毒的一種，噬菌體具有病毒特有的一些特性:個(gè)體微小，不具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只含有單一核酸。噬菌體基因組含有許多個(gè)基因，但所有已知的噬菌體都是在細(xì)菌細(xì)胞中利用細(xì)菌的核糖體、蛋白質(zhì)合成時(shí)所需的各種因子、各種氨基酸和能量產(chǎn)生系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)其自身的生長和增殖。一旦離開了宿主細(xì)胞，噬菌體既不能生長，也不能復(fù)制。作為整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，噬菌體在基因的轉(zhuǎn)移、生物的進(jìn)化等方面展示了重要的意義。同時(shí)，噬菌體在遺傳學(xué)方面的研究以及分子生物學(xué)等方面的研究都起到了十分重要的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前大約已有5450株的病毒被分離、報(bào)道。但是，截至到目前為止，僅有不超過30株的嗜鹽古生菌噬菌體被分離。
[0004]在噬菌體與宿主長期共存的環(huán)境中，溶源與裂解是兩種常見的相互作用形式。溶源是指溫和噬菌體在吸附和侵入宿主細(xì)胞后，將噬菌體基因組整合在宿主細(xì)胞染色體上，隨宿主DNA復(fù)制而同步復(fù)制，隨宿主細(xì)胞分裂而傳遞到兩個(gè)子細(xì)胞中，宿主細(xì)胞可正常繁殖，以上過程稱為“溶源周期”，但在一定條件下，噬菌體基因組可進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生并釋放子代噬菌體，即“裂解周期”。裂解是指烈性噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠完成增殖過程，產(chǎn)生并釋放大量子代噬菌體并裂解宿主細(xì)胞。但在對嗜鹽古生菌及其噬菌體的研究中發(fā)現(xiàn)，除了上述溶源與裂解外，二者還有一類假溶源存在形式。簡單的說，假溶源就是指噬菌體基因組在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，噬菌體的DNA不整合到宿主的染色體上，而是以質(zhì)粒的形式獨(dú)立存在，隨著宿主的生長不斷的向周圍環(huán)境中釋放噬菌體子代而宿主自身不裂解。
[0005]嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體通常采用以下方法進(jìn)行鑒定:首先將待檢測嗜鹽古生菌涂布在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)以形成單菌落，此過程大約5~7d，然后分別挑選單菌落至盛有新鮮的液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)3~4d，再取一定量的液體培養(yǎng)物離心，并用移液器取2~3 μ L上清液滴在倒好的雙層平板上(雙層平板的上層含有指示菌)，然后放到恒溫箱中培養(yǎng)2d，之后觀察是否在雙層平板上形成透明的噬菌斑。整個(gè)鑒定過程大約耗時(shí)10~13d，不僅鑒定周期較長，而且鑒定工序較復(fù)雜，成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的鑒定周期較長，鑒定工序較復(fù)雜，成本較高的問題，提供一種鑒定周期較短、簡單易行、成本較低的嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:
[0008]一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，該方法依次包括以下步驟:
[0009]步驟一:一號培養(yǎng)基、二號培養(yǎng)基的配置:
[0010]所述一號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物，再將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到一號培養(yǎng)基；
[0011]所述二號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂4~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到二號培養(yǎng)基；
[0012]步驟二:待測嗜鹽古生菌的培養(yǎng):先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固后在其上均勻涂布待測嗜鹽古生菌，再將涂布有待測嗜鹽古生菌的一號培養(yǎng)基于42~45°C培養(yǎng)至形成單菌落；
[0013]步驟三:雙層平板的制備:先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固干燥后，將培養(yǎng)到對數(shù)期的指示菌液與42~45°C下的二號培養(yǎng)基混合均勻以形成混合培養(yǎng)液，然后將該混合培養(yǎng)液倒入一號培養(yǎng)基上，并使混合培養(yǎng)液凝固以形成雙層平板，其中，所述指示菌為Natrinema sp.J7-2嗜鹽古生菌，所述指示菌液的體積為300 μ L，二號培養(yǎng)基的體積為4.7~5mL ；
[0014]步驟四:噬菌體的鑒定:將步驟二中形成的單菌落接種到雙層平板上，并于42~45°C下恒溫培養(yǎng)2d后觀察雙層平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)寄宿有假溶源性噬菌體SNJ1，若未形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)未寄宿假溶源性噬菌體SNJ1，此時(shí)，嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定完成。
[0015]步驟四中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，然后挑取單菌落直接移殖到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)。
[0016]步驟四中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，再挑取單菌落并將其加入到20 μ L液體培養(yǎng)基中混合均勻，然后取6 μ L混有單菌落的液體培養(yǎng)基滴加到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)，其中，所述液體培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液，然后將該混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到液體培養(yǎng)基。
[0017]步驟四中，所述接種是指采用影印法將單菌落影印到雙層平板上。
[0018]步驟二中，所述待測嗜鹽古生菌的培養(yǎng)時(shí)間為5~7d。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0020]1、本發(fā)明一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法先將待檢測嗜鹽古生菌涂布在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)以形成單菌落，再將單菌落接種至上層含有指示菌的雙層平板上恒溫培養(yǎng)，最后觀察噬菌斑的形成狀況，用時(shí)7~9d，與常規(guī)鑒定方法相比，該法省略了對單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)并離心獲得噬菌體的步驟，無需將噬菌體與宿主細(xì)胞分離即可對其進(jìn)行鑒定，不僅縮短了鑒定周期，而且簡化了鑒定步驟，降低了成本。因此，本發(fā)明不僅縮短了鑒定周期，而且簡化了鑒定步驟，降低了成本。
[0021]2、本發(fā)明一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法中噬菌體的鑒定步驟采用影印法將單菌落接種到雙層平板上，該法可同時(shí)完成將多個(gè)單菌落從一個(gè)平板移殖到另一平板上的接種任務(wù)，不僅節(jié)約了接種時(shí)間，而且有效降低了批量鑒定的工作量。因此，本發(fā)明有效降低了批量鑒定的工作量。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023]一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，該方法依次包括以下步驟:
[0024]步驟一:一號培養(yǎng)基、二號培養(yǎng)基的配置:
[0025]所述一號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物，再將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到一號培養(yǎng)基；
[0026]所述二號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂4~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到二號培養(yǎng)基；
[0027]步驟二:待測嗜鹽古生菌的培養(yǎng):先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固后在其上均勻涂布待測嗜鹽古生菌，再將涂布有待測嗜鹽古生菌的一號培養(yǎng)基于42~45°C培養(yǎng)至形成單菌落；
[0028]步驟三:雙層平板的制備:先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固干燥后，將培養(yǎng)到對數(shù)期的指示菌液與42~45°C下的二號培養(yǎng)基混合均勻以形成混合培養(yǎng)液，然后將該混合培養(yǎng)液倒入一號培養(yǎng)基上，并使混合培養(yǎng)液凝固以形成雙層平板，其中，所述指示菌為Natrinema sp.J7-2嗜鹽古生菌，所述指示菌液的體積為300 μ L，二號培養(yǎng)基的體積為4.7~5mL ；`
[0029]步驟四:噬菌體的鑒定:將步驟二中形成的單菌落接種到雙層平板上，并于42~45°C下恒溫培養(yǎng)2d后觀察雙層平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)寄宿有假溶源性噬菌體SNJ1，若未形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)未寄宿假溶源性噬菌體SNJ1，此時(shí)，嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定完成。
[0030]步驟四中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，然后挑取單菌落直接移殖到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)。
[0031]步驟四中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，再挑取單菌落并將其加入到20 μ L液體培養(yǎng)基中混合均勻，然后取6 μ L混有單菌落的液體培養(yǎng)基滴加到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)，其中，所述液體培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液，然后將該混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到液體培養(yǎng)基。
[0032]步驟四中，所述接種是指采用影印法將單菌落影印到雙層平板上。
[0033]步驟二中，所述待測嗜鹽古生菌的培養(yǎng)時(shí)間為5~7d。
[0034]本發(fā)明的原理說明如下:
[0035]本發(fā)明以對假溶源性噬菌體SNJl敏感的Natrinema sp.J7-2嗜鹽古生菌(該菌株于1997年保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCN0.AB91141)作為指示菌，由于假溶源性噬菌體SNJl會隨著宿主的生長不斷的向周圍環(huán)境中釋放噬菌體子代，因此本發(fā)明利用假溶源性噬菌體SNJl的該特性直接將其連同宿主細(xì)胞接種至上層含有指示菌的雙層平板上恒溫培養(yǎng)，觀察噬菌斑的形成狀況，無需對單菌落進(jìn)行增殖培養(yǎng)并使噬菌體與宿主細(xì)胞分離即可對噬菌體進(jìn)行鑒定，是一種簡便快速、且成本較低的鑒定方法。
[0036]本發(fā)明中噬菌體的鑒定步驟采用影印法將單菌落接種到雙層平板上，無需單獨(dú)挑取每個(gè)單菌落后接種到相應(yīng)的等分區(qū)塊內(nèi)，可同時(shí)完成多個(gè)菌落從一個(gè)平板轉(zhuǎn)移到另一平板上的接種任務(wù)，有利于批量鑒定。
[0037]本發(fā)明方法也同樣適用于其他假溶源性噬菌體的鑒定。
[0038]實(shí)施例1:[0039]一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，該方法依次包括以下步驟:
[0040]步驟一:一號培養(yǎng)基、二號培養(yǎng)基的配置:
[0041]所述一號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物，再將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到一號培養(yǎng)基；
[0042]所述二號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到二號培養(yǎng)基；
[0043]步驟二:待測嗜鹽古生菌的培養(yǎng):先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固后在其上均勻涂布待測嗜鹽古生菌，再將涂布有待測嗜鹽古生菌的一號培養(yǎng)基于42~45°C培養(yǎng)5~7d以形成單菌落；
[0044]步驟三:雙層平板的制備:先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固干燥后，再將培養(yǎng)到對數(shù)期的指示菌液與42~45°C下的二號培養(yǎng)基混合均勻以形成混合培養(yǎng)液，然后將該混合培養(yǎng)液倒入一號培養(yǎng)基上，并使混合培養(yǎng)液凝固以形成雙層平板，其中，所述指示菌為Natrinema sp.J7-2嗜鹽古生菌,所述指示菌液的體積為300 μ L, 二號培養(yǎng)基的體積為4.7~5mL ;
[0045]步驟四:噬菌體的鑒定:將步驟二中形成的單菌落接種到雙層平板上，并于42~45°C下恒溫培養(yǎng)2d后觀察雙層平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)寄宿有假溶源性噬菌體SNJ1，若未形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)未寄宿假溶源性噬菌體SNJ1，此時(shí)，嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定完成，其中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，然后挑取單菌落直接移殖到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)。
[0046]本實(shí)施方法的檢出率為93%。
[0047]實(shí)施例2:
[0048]步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:
[0049]步驟一中，二號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂4g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到二號培養(yǎng)基。
[0050]本實(shí)施方法的檢出率為96%。
[0051]實(shí)施例3:
[0052]步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:[0053]步驟四中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，再挑取單菌落并將其加入到20 μ L液體培養(yǎng)基中混合均勻，然后取6 μ L混有單菌落的液體培養(yǎng)基滴加到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)，其中，所述液體培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液，然后將該混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到液體培養(yǎng)基。
[0054]本實(shí)施方法的檢出率為100%。
[0055]實(shí)施例4:
[0056]步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:
[0057]步驟四中，所述接種是指采用影印法將單菌落影印到雙層平板上。
[0058]本實(shí)施方法的檢 出率為92%。
【權(quán)利要求】
1.一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，其特征在于該方法依次包括以下步驟: 步驟一:一號培養(yǎng)基、二號培養(yǎng)基的配置: 所述一號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,再將該固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到一號培養(yǎng)基； 所述二號培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、瓊脂4~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,再將該固液混合物于0.69X 105Pa、100~125°C下滅菌10~60min以得到二號培養(yǎng)基； 步驟二:待測嗜鹽古生菌的培養(yǎng):先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固后在其上均勻涂布待測嗜鹽古生菌，再將涂布有待測嗜鹽古生菌的一號培養(yǎng)基于42~45°C培養(yǎng)至形成單菌落； 步驟三:雙層平板的制備:先向平皿中倒入一號培養(yǎng)基，待一號培養(yǎng)基凝固干燥后，將培養(yǎng)到對數(shù)期的指示菌液與42~45°C下的二號培養(yǎng)基混合均勻以形成混合培養(yǎng)液，然后將該混合培養(yǎng)液倒入一號培養(yǎng)基上，并使混合培養(yǎng)液凝固以形成雙層平板，其中，所述指示菌為Natrinema sp.J7-2嗜鹽古生菌，所述指示菌液的體積為300 μ L，二號培養(yǎng)基的體積為 4.7 ~5mL ； 步驟四:噬菌體的鑒定:將步驟二中形成的單菌落接種到雙層平板上，并于42~45°C下恒溫培養(yǎng)2d后觀察雙層平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)寄宿有假溶源性噬菌體SNJ1，若未形成噬菌斑則表明待測嗜鹽古生菌內(nèi)未寄宿假溶源性噬菌體SNJ1，此時(shí)，嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體S`NJl的鑒定完成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，其特征在于:步驟四中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，然后挑取單菌落直接移殖到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，其特征在于:步驟四中，所述接種是指先在平皿的背面劃分多個(gè)等分區(qū)塊，再挑取單菌落并將其加入到20 μ L液體培養(yǎng)基中混合均勻，然后取6 μ L混有單菌落的液體培養(yǎng)基滴加到雙層平板上的等分區(qū)塊內(nèi)，其中，所述液體培養(yǎng)基的配置方法為:先稱取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液,然后將該混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下滅菌10~60min以得到液體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，其特征在于:步驟四中，所述接種是指采用影印法將單菌落影印到雙層平板上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的一種嗜鹽古生菌假溶源性噬菌體SNJl的鑒定方法，其特征在于:步驟二中，所述待測嗜鹽古生菌的培養(yǎng)時(shí)間為5~7d。
【文檔編號】C12Q1/70GK103695564SQ201310731028
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】梅運(yùn)軍, 何聰聰, 胡純, 張順喜, 黃詠馳 申請人:武漢輕工大學(xué)