一種用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒，它包括以下成分：松木及其制品松材線蟲檢測正向引物、反向引物和熒光探針；Premix?Ex?Taq；松材線蟲DNA模板；滅菌雙蒸水；DNA裂解液；蛋白酶K。本發明還公開了上述試劑盒檢測松木及其制品中松材線蟲的方法，與現有技術比較，本發明的松木及其制品松材線蟲檢測試劑盒中引物與探針具有更強的特異性、更高的靈敏度，且對松木及其制品可以進行直接松材線蟲檢測，檢測程序與結果判讀程序均為自動化處理，檢測結果以樣品“含有松材線蟲”或“不含有松材線蟲”顯示。從而為松材線蟲病的疫情檢測、鑒定提供了更加快速、便利、高效的檢測方法。
【專利說明】一種用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物保護領域，涉及一種用于直接檢測松木及其制品是否含有松材線蟲的檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是引起松樹毀滅性傳染病害-松材
線蟲病的病原物。1982年我國在南京首次發現該病。三十多年來，該病迅速擴散到江蘇、安徽、浙江、廣東、山東等我國大陸十六個省(區)，直接經濟損失42億元，間接經濟損失達千億元。且每年以6000hm2的速度擴散。近年來，疫情逐步向我國北方省份蔓延。據國家林業局林業有害生物檢驗鑒定技術培訓中心的統計，2009年該病已擴散到河南、陜西兩省，已對我國部分地區松林資源、自然景觀和生態環境造成嚴重破壞，并對大面積林區及松林景觀生態區域構成嚴重威脅。分析我國疫情發生特點，病害流行大多由人為傳播松木及其制品引起。此外，部分地區沒能及時監測到疫情存在而導致疫情進一步擴散。松材線蟲病之所以能夠快速蔓延，暢通無阻，其主要原因之一就是在實踐中缺乏快速、有效的檢驗檢疫手段，以至于我國大多數森林植物檢疫檢查站的日常檢疫工作流于形式而沒有真正發揮其應有的效能。 [0003]由于松材線蟲的形態學檢疫技術存在一些形態學鑒別特征重疊現象，加之幼蟲、雄蟲不能夠定性鑒定。因此,不少學者開始在遺傳學、免疫學、病理學和生理生化(酶學、血清學、性外激素、染色體數)等方面做了大量工作，對于松材線蟲的檢測起到了積極的作用。
[0004]目前在松材線蟲的分子檢測方面，主要包含三大類。第一類是普通PCR檢測方法，如南京農業大學的專利“松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法”(申請號:200310106109.5)以及云南農業大學的專利“一種松樹萎蔫病病原線蟲的快速檢測方法”(申請號:200510048722.5)，這些檢測方法費時長、檢測過程復雜，不便于生產上應用。且未應用于實際生產上；第二類是實時熒光PCR檢測方法，如中國科學院微生物研究所的專利“一種檢測松材線蟲的方法及其專用引物和探針”(申請號:200310109374.9)、上海市林業病蟲害防治檢疫站和南京農業大學植物保護學院的專利“松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法”(申請號:200510026710.2)，以及南京林業大學的專利“一種松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法”(申請號:200810124385.7)等，這些檢測方法或多或少地存在檢測特異性不強問題、且檢測精度還有待提高，因而也沒有在生產實踐中應用；第三類是恒溫擴增檢測技術，如南京林業大學與杭州優思達生物技術有限公司的專利“一種定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法”(2012103035323)，該項檢測技術還有待生產上的驗證。
[0005]以上松材線蟲分子檢測方法，首先都必須從可疑松木或松木制品中分離獲得線蟲，然后再對線蟲進行檢測、鑒定。僅線蟲分離這一項工作就需8-12小時。難以滿足各森林植物檢疫檢查站的快速檢疫需求。從快速檢疫的角度而言，上述松材線蟲分子檢測技術與方法距離快速檢疫還有一定的差距。為滿足檢疫檢驗實踐中的快速鑒定要求，有必要開發更為簡便、快速、高效的檢測鑒定技術與方法。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠快速、準確、便利的直接檢測松木及其制品是否含有松材線蟲的檢測試劑盒。
[0007]本發明還要解決的一個技術問題是采用上述試劑盒檢測松材線蟲的方法。
[0008]為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下:
[0009]一種用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于，它包括以下成分:
[0010](I)松木及其制品松材線蟲檢測正向引物、反向引物和熒光探針:
[0011]正向引物(F):5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'；
[0012]反向引物(R):5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'；
[0013]熒光探針(P):5,-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'；
[0014](2) Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2XCone.);
[0015](3)陽性對照:松材線蟲DNA模板，濃度為0.5_5ng/ μ L ；
[0016](4)陰性對照:滅菌雙蒸水；
[0017](5) DNA 裂解液 '2.0 ~3.0mM 二硫蘇糖醇(DTT)，1.0 ~1.5ν/ν% 吐溫 20(Tween20),0.8 ~1.2mM 明膠(Gelatin)，1.0 ~1.5mM KCl, 1.0 ~2.0mM ρΗ8.3 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-Cl)，3.0~4.0mM MgCl2 ；
[0018](6)蛋白酶 K (Proteinase K)。
[0019]其中，所述的DNA裂解液，其配方優選為:2.0mM 二硫蘇糖醇，1.0ν/ν%吐溫20，0.8禮明膠，1.01111 KCl, 1.0mM pH8.3三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，3.0mM MgCl2。
[0020]其中，所述的蛋白酶K濃度為20~40mg/mL,優選為20mg/mL。所述的蛋白酶的酶活力要求30U/mg以上。酶活定義是:在37°C，以血紅蛋白為底物，I分鐘內可以產生相當于I微摩爾酪氨酸Folin陽性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定義為一個單位蛋白酶K酶活力。
[0021]上述試劑盒檢測松木及其制品中松材線蟲的方法，它包括如下步驟:
[0022](I)取樣:對每份送檢松木或其制品，用電鉆鉆取3~5個不同位置的碎木屑，混合；
[0023](2)DNA的提取:取碎木屑I~2g于50mL的離心管內，使木屑集中在離心管底部，加入5~8mL的DNA裂解液，再加入20~40mg/mL5 μ L蛋白酶K，將離心管置于68~70°C條件下反應40~45min，然后置于93~95°C條件下反應5~IOmin ;以12000~13000rpm的轉速離心3~5min，取上清液100~300 μ L，置于1.5mL離心管，再向其中加入400~500 μ L滅菌雙蒸水，以12000~13000rpm的轉速離心3~5min,取3.5 μ L上清液，用于檢測；
[0024](3)檢測體系:總體積 IOyL,包括 5yL Premix Ex Taq、0.5 μ LlO μ M 正向引物、0.5 μ LlO μ M反向引物、0.5 μ LlO μ M熒光探針、3.5 μ L檢測樣品的上清液；
[0025](4)樣品檢測:將上述檢測體系置于松材線蟲自動化分子檢測系統進行自動程序檢測，自動程序判讀檢測結果。
[0026]步驟(1)中，電鉆鉆頭直徑為8~10mm。[0027]步驟(2)中，優選的方式是:取碎木屑I~2g于50mL的離心管內，使木屑集中在離心管底部，加入6mL的DNA裂解液，再加入20mg/mL5 μ L蛋白酶K，將離心管置于68~70°C條件下反應40min，然后置于95°C條件下反應10min ;以12000rpm的轉速離心3min，取上清液100 μ L，置于1.5mL離心管，再向其中加入400 μ L滅菌雙蒸水，以12000rpm的轉速離心3min，取3.5μ L上清液，用于檢測。
[0028]有益效果:與現有技術比較，本發明的進步在于:
[0029](1)檢測準確性。本發明的引物和探針，經過全國550多分不同地點的樣品檢測，其準確率達到100%。在檢測驗證樣品的數量上，超過其它檢測技術。
[0030](2)檢測靈敏度。本發明的引物和探針，達到的最大檢測精度為樣品模板的DNA濃度為0.0002pg。超過現有的其它檢測技術。
[0031](3)檢測實用性。本發明的裂解液，具有直接裂解松木及其制品中線蟲的DNA作用。因此，在實際檢測過程中，可以省略從松木或其制品中分離線蟲的過程，可以直接用松木或松木制品進行檢測。具有很強的實用性。
[0032](4)檢測便利。本發明的檢測方法，采用松材線蟲自動化分子檢測而系統，擁有自動化的檢測程序、結果判讀程序，操作更便利。
[0033](5)實際應用。并且已經在全國危險性林業有害生物檢驗鑒定技術培訓中心實踐應用3年以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1利用本發明的正引物、反向引物與熒光探針對不同種類線蟲的特異性檢測結果。其中，B1:松材線蟲AMA3 ；B2:擬松材線蟲NL5 ；B3:萊奴爾夫傘滑刃線蟲ZH13 ；B4:李氏長尾線蟲JClO ；B5:泰國傘滑刃線蟲JLOl ；B6:吳氏長尾線蟲JY13 ；B7:霍夫曼尼傘滑刃線蟲SF2 ；B8:大核滑刃線蟲GHHC2 ；B9:赫列尼庫斯傘滑刃線蟲ZNOl ；B10:陽性對照01 ；Bll:陰性對照01。
[0035]BI (松材線蟲AMA3)與BlO (陽性對照01)含有松材線蟲，而其它8種線蟲均不含有松材線蟲。
[0036]圖2利用本發明的正引物、反向引物與熒光探針靈敏度檢測結果。B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9 (陰性對照)的松材線蟲 DNA 濃度分別為 1.75ng/ μ L、0.175ng/ μ L、0.0175ng/μ L、l.75pg/μ L、0.175pg/μ L、0.0175pg/μ L、0.00175pg/μ L、0.000175pg/μ L>0pg/μ L0
【具體實施方式】
[0037]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0038]實施例1:引物與探針設計
[0039]根據本研究小組測定的6種傘滑刃屬線蟲Bursaphelenchus hellenicus、B.hofmann1、B.mucronatus、B.rainulf1、B.thailandae、B.xylophilus 以及 2 種長尾屬線蟲 Seinura li1、S.wuae 和 I 種滑韌線蟲屬線蟲 Aphelenchoides macronucleatus 的ITS序列，再結合從Genebank中搜索到的30種傘滑刃屬線蟲B.abietinus、B.anamurius、B.antoniae、B.arthur1、B.borealis、B.braaschae、B.clavicauda、B.conicaudatus、B.corneolus、B.eggers1、B.eremus、B.fungivorus、B.gerber1、B.hildegardae>B.hylobianum、B.0kinawaensis、B.paracorneoIus、B.paraparvispicularis、B.parathailandae、B.pinaster1、B.pinophilus、B.platzer1、B.poligraph1、B.sean1、B.sexdentat1、B.sinensis、B.tusciae、B.vallesianus、B.willibald1、B.yongensis 的ITS序列，采用BioEid軟件對上述39種線蟲的Its區序列進行比對，在存在較多的堿基差異的內部轉錄區2區域,利用Premier express3.0軟件設計了松材線蟲的引物與突光探針。
[0040]其中，
[0041]正向引物(F):5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'，
[0042]反向引物(R): 5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'，
[0043]熒光探針(P):5,-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'。
[0044]將以上引物與探針用于松木及其制品的松材線蟲分子檢測。
[0045]實施例2:
[0046]—種用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于，它包括以下成分:
[0047](I)松木及其制品松材線蟲檢測正向引物、反向引物和熒光探針:
[0048]正向引物(F):5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'；
[0049]反向引物(R):5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'；
[0050]熒光探針(P):5,-FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'；
[0051](2) Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2XCone.);
[0052](3)陽性對照:松材線蟲DNA模板，濃度為0.5_5ng/ μ L ；
[0053](4 )陰性對照:滅菌雙蒸水；
[0054](5) DNA 裂解液:2.0 ~3.0mM 二硫蘇糖醇(DTT)，1.0 ~1.5v/v% 吐溫 20(Tween20),0.8 ~1.2mM 明膠(Gelatin)，1.0 ~1.5mM KCl, 1.0 ~2.0mM ρΗ8.3 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-Cl)，3.0~4.0mM MgCl2 ；
[0055](6)蛋白酶 K (Proteinase K)。
[0056]實施例3:
[0057]上述試劑盒檢測松木及其制品中松材線蟲的方法，它包括如下步驟:
[0058](I)取樣:對每份送檢松木或其制品，用電鉆鉆取3~5個不同位置的碎木屑(鉆頭直徑為8~IOmm),混合；
[0059](2)DNA的提取:取碎木屑I~2g于50mL的離心管內，使木屑集中在離心管底部，加入5~8mL的DNA裂解液，再加入20~40mg/mL5 μ L蛋白酶K，將離心管置于68~70°C條件下反應40~45min，然后置于93~95°C條件下反應5~IOmin ;以12000~13000rpm的轉速離心3~5min，取上清液100~300 μ L，置于1.5mL離心管，再向其中加入400~500 μ L滅菌雙蒸水，以12000~13000rpm的轉速離心3~5min,取3.5 μ L上清液，用于檢測；
[0060](3)檢測體系:總體積 IOyL,包括 5yL Premix Ex Taq、0.5 μ LlO μ M 正向引物、
0.5 μ LlO μ M反向引物、0.5 μ LlO μ M熒光探針、3.5 μ L檢測樣品的上清液；[0061](4)樣品檢測:將上述檢測體系置于松材線蟲自動化分子檢測系統(BX-48，生產廠家:杭州博日科技有限公司，銷售公司:南京生興有害生物防治技術有限公司)進行自動程序檢測，自動程序判讀檢測結果。
[0062]實施例4:特異性檢測。
[0063]1、線蟲DNA提取
[0064]分別將9種不同的線蟲(見表1)置于9個1.5mL的離心管中，再加入20 μ L的線蟲 DNA 裂解液(2.0mM DTT, 1.0% (v/v) Tween20,0.8mM Gelatin, 1.0mM KCl, 1.0mMTris-Cl (pH8.3),3.0mM MgCl2, 20mg/mL Proteinase K)。置于 68_70°C條件下 40min，然后置于95°C條件下IOmin ;以12000rpm的轉速離心3min,取3.5 μ L上清液用于檢測。
[0065]2、檢測體系
[0066]總體積10 μι,包括 5 μ L Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2XConc.)、0.5 μ L 正向引物(F)、0.5μ L反向引物(F)、0.5μ L熒光探針、3.5 μ L檢測樣品的上清液。陽性對照用3.5 μ L濃度為0.5ng/ μ L的松材線蟲DNA液，陰性對照用3.5 μ L滅菌雙蒸水。
[0067]3、樣品檢測
[0068]將上述檢測體系置于松材線蟲自動化分子檢測系統(ΒΧ-48)進行自動程序檢測。
[0069]4、結果判讀
[0070]自動程序判讀結果 如圖1所示，BI (松材線蟲ΑΜΑ3)與BlO (陽性對照01)含有松材線蟲，而其它8種線蟲Β2(擬松材線蟲NL5)、Β3 (萊奴爾夫傘滑刃線蟲ΖΗ13)、Β4 (李氏長尾線蟲JC10)、B5 (泰國傘滑刃線蟲JL01)、B6 (吳氏長尾線蟲JY13)、B7 (霍夫曼尼傘滑刃線蟲SF2)、B8 (大核滑刃線蟲GHHC2)、B9 (赫列尼庫斯傘滑刃線蟲ZN01)以及Bll (陰性對照01)均不含有松材線蟲。
[0071]表1供試線蟲株系代號和來源
[0072]
【權利要求】
1.一種用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于，它包括以下成分: (1)松木及其制品松材線蟲檢測正向引物、反向引物和熒光探針: 正向引物:5' -GAGCAGAAACGCCGACTT-3'； 反向引物:5' -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'； 熒光探針:5' -FAM-TGCACGTTGTGACAGTCGT-BHQ1-3'；
(2)Premix Ex Taq ； (3)陽性對照:松材線蟲DNA模板； (4)陰性對照:滅菌雙蒸水； (5)DNA裂解液:2.0~3.0mM 二硫蘇糖醇，1.0~L 5v/v%吐溫20，0.8~L 2mM明膠，1.0~1.5mM KCl，1.0~2.0mM pH8.3三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，3.0~4.0mM MgCl2 ； (6)蛋白酶K。
2.根據權利要求1所述的用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于，所述的DNA裂解液，其配方為:2.0mM 二硫蘇糖醇，1.0ν/ν%吐溫20，0.8mM明膠，1.0mM KCl,1.0mM pH8.3三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，3.0mM MgCl20
3.根據權利要求1所述的用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于，所述的蛋白酶K濃度為20~40mg/mL。
4.根據權利要求3所述的用于松木及其制品的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于，所述的蛋白酶K濃度為20mg/mL。`
5.權利要求1所述的試劑盒檢`測松木及其制品中松材線蟲的方法，其特征在于，它包括如下步驟: (1)取樣:對每份送檢松木或其制品，用電鉆鉆取3~5個不同位置的碎木屑，混合； (2)DNA的提取:取碎木屑I~2g于50mL的離心管內，使木屑集中在離心管底部，加入5~8mL的DNA裂解液，再加入20~40mg/mL5 μ L蛋白酶K，將離心管置于68~70°C條件下反應40~45min，然后置于93~95°C條件下反應5~IOmin ;以12000~13000rpm的轉速離心3~5min，取上清液100~300 μ L，置于1.5mL離心管，再向其中加入400~500 μ L滅菌雙蒸水，以12000~13000rpm的轉速離心3~5min,取3.5 μ L上清液,用于檢測； (3)檢測體系:總體積10μL，包括5μ L Premix Ex Taq、0.5 μ LlO μ M正向引物、0.5 μ LlO μ M反向引物、0.5 μ LlO μ M熒光探針、3.5 μ L檢測樣品的上清液； (4)樣品檢測:將上述檢測體系置于松材線蟲自動化分子檢測系統進行自動程序檢測，自動程序判讀檢測結果。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，電鉆鉆頭直徑為8~10mm。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，取碎木屑I~2g于50mL的離心管內，使木屑集中在離心管底部，加入6mL的DNA裂解液，再加入20mg/mL5 μ L蛋白酶K，將離心管置于68~70°C條件下反應40min，然后置于95°C條件下反應10min ;以12000rpm的轉速離心3min，取上清液100 μ L，置于1.5mL離心管，再向其中加入400 μ L滅菌雙蒸水，以12000rpm的轉速離心3min,取3.5 μ L上清液,用于檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667497SQ201310732392
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】陳鳳毛, 葉建仁, 吳小芹 申請人:南京林業大學