植物中雄性育性的遺傳減少的制作方法
【專利摘要】本發明提供了遺傳雄性不育植物，在所述遺傳雄性不育植物中補充構建體從而產生對所述子代中的親本表型的抑制。提供了產生和保持此類植物的方法以及使用所述植物的方法，包括使用親本植物以產生不育植物以用于雜交種子生產。
【專利說明】植物中雄性育性的遺傳減少
[0001] 交叉引用
[0002] 本申請要求提交于2012年3月13日的美國臨時專利申請61/610,243、提交于 2013年3月12日的PCT申請PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12日的PCT申請 PCT/US2013/30455的優先權和權益，其公開內容據此以引用方式并入。

【技術領域】
[0003] 本發明整體涉及分子生物學領域，具體地講涉及植物育性的調節以提高植物脅迫 耐受性。
[0004] 背景信息
[0005] 許多植物的馴化已與產量顯著增加相關。天然群體中發生的大多數表型變異是連 續的并且受多種基因影響的作用。對造成馴化植物中產量顯著不同的特定基因的識別已成 為農業研究的重要焦點。
[0006] 植物在發育生命周期期間在各種植物組織間分配光合產物、礦質營養和其他生長 組分。在玉蜀黍中，例如，穗和穗絲為共享某些發育過程并且相互競爭所需營養物質的特定 雌性和雄性花序結構。穗絲頂端顯性可限制玉蜀黍植物中的穗生長和谷粒產量潛力，本文 公開了提高谷粒產量的方法和組合物。


【發明內容】

[0007] -種用于增加植物中的產量或維持產量穩定性的方法，該方法包括減少雄性育 性，從而在雄性和雌性組織同時發育期間增加分配至雌性生殖組織的營養物質。在一個實 施例中，通過改變遺傳雄性育性基因的表達或活性來減少植物中的雄性育性。在一個實施 例中，植物在非生物脅迫下生長。在一個實施例中，營養物質限定為氮。在一個實施例中， 具有減少的雄性育性的植物具有選自如下的農學參數：增大的SPAD值、增加的抽穗絲、增 加的穗長度、增加的穗寬度、增加的每個穗的種子數、增加的每個穗的種子重量和具有增加 的胚尺寸的種子。在一個實施例中，植物在干旱脅迫下生長。在一個實施例中，通過雄性不 育來提高植物的耐旱性。
[0008] -種用于增加玉蜀黍植物中的產量或維持產量穩定性的方法，該方法包括減少雄 性育性，從而在雄性和雌性組織同時發育期間增加分配至雌性生殖組織的營養物質。在一 個實施例中，植物包含導致顯性遺傳雄性不育的核基因中的突變。
[0009] 在一個實施例中，本文公開的植物的雄性育性通過表達編碼SEQ ID N0S:14或 153的多肽的多核苷酸而減少。在一個實施例中，多核苷酸選自SEQ ID NOS :13、15和152。
[0010] 在一個實施例中，雄性育性在選自 SEQ ID NO :64-106、134、137、142、143、144、149 和150的調控元件下通過表達抑制穗絲的核酸而減少。
[0011] 在一個實施例中，雄性育性在選自 SEQ ID N0 :64-106、134、137、142、143、144、149 和150的調控元件下通過表達核酸而減少，所述核酸抑制編碼SEQ ID NO :107的氨基酸序 列的多核苷酸的表達。
[0012] 在一個實施例中，雄性育性通過表達編碼多肽的核酸而減少，所述多肽具有對應 于SEQ ID N0:14的第37位氨基酸的突變，其中多肽選自SEQ ID N0:14、108-130。在一個 實施例中，突變導致信號肽的不當加工。
[0013] 在一個實施例中，表現出減少的雄性育性的植物為玉蜀黍非轉基因植物。在一個 實施例中，雌性組織發育為玉蜀黍中的穗發育。
[0014] 在一個實施例中，導致減少的雄性育性的突變在植物的內源育性基因中進行改 造。
[0015] 一種在具有第一玉蜀黍植物群體的田地中增加玉蜀黍產量的方法，該方法包括在 田地中栽培玉蜀黍植物群體，其中玉蜀黍植株由于存在包含SEQ ID N0 :14或其同系物的氨 基酸序列的多肽而表現出顯性雄性不育，并且其中所述田地還包含第二玉蜀黍植物群體， 所述第二玉蜀黍植物群體產生有效量的花粉以使田地中的第一玉蜀黍植物群體受精，從而 相較于不包含第一植物群體的對照田地產量增加。在一個實施例中，第一植物群體包括田 地中玉蜀黍植株的約50%至約90%。在一個實施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植 株的約80%。在一個實施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植株的約75%。在一個實 施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植株的約85 %。在一個實施例中，第一植物群體包 括田地中玉蜀黍植株的約70%。在一個實施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植株的 約95 %。在一個實施例中，所得的子代是可育的。
[0016] 在田地中生長的玉蜀黍植物群體，其中玉蜀黍植物群體包括具有減少的雄性育性 的第一亞群體和表現出正常的雄性育性的第二亞群體，其中所述玉蜀黍植物群體產生與對 照植物群體相比增加的谷粒產量。在一個實施例中，種子由玉蜀黍植株產生，其中所述種子 產生可育的植株。
[0017] 一種具有多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸引發植物細胞中的轉錄并且 包括選自如下的序列：
[0018] a. SEQ ID N0 :13 和 62、SEQ ID N0 :64-106、134、137、142、143、144、149 和 150 的 啟動子區；
[0019] b. SEQ ID N0 :13、62、64-106、134、137、142、143、144、149 和 150 的至少 100 個連 續核苷酸；以及
[0020] c.與 SEQ ID N0 :13、62、64-106、134、137、142、143、144、149和150的全長具有至 少70%序列同一性的核苷酸序列。
[0021] 表達盒具有引發如本文所公開的轉錄并且可操作地連接到目的多核苷酸的多核 苷酸。在一個實施例中，載體包括本文所述的表達盒。在一個實施例中，植物細胞已將本文 所述的表達盒穩定摻入到其基因組中。在一個實施例中，植物細胞來自單子葉植物。在一 個實施例中，單子葉植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕麥、裸麥、高粱或水稻。
[0022] 在一個實施例中，包括已將本文所述的表達盒穩定摻入到其基因組中的植物。在 一個實施例中，植物為單子葉植物。在一個實施例中，植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕麥、裸 麥、高粱或水稻。
[0023] 公開了本文所述的植物的轉基因種子。在一個實施例中，公開了編碼基因產物的 多核苷酸，所述基因產物賦予病原體或昆蟲抗性。
[0024] 在一個實施例中，植物還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽涉及營養物質吸收、 氮利用效率、耐旱性、根強度、根耐倒伏性、土壤害蟲管理、玉米根蟲抗性、碳水化合物代謝、 蛋白質代謝、脂肪酸代謝或植物激素生物合成。
[0025] -個單位玉蜀黍種子，其包括一部分為轉基因的雄性不育種子和一部分為轉基因 的雄性可育種子，其中雄性不育轉基因種子與該單位中總玉蜀黍種子的比例在約50%至約 95%的范圍內。在一個實施例中，一個單位為一袋玉蜀黍種子。
[0026] 玉蜀黍種子的種子混合物，其包括一部分為轉基因的雄性不育種子和一部分為轉 基因的雄性可育種子，其中雄性不育轉基因種子與該單位中總玉蜀黍種子的比例在約50% 至約95%的范圍內。在一個實施例中，種子混合物在一袋玉蜀黍種子中。在一個實施例中， 雄性不育種子在單獨的袋中。在一個實施例中，雄性不育種子與雄性可育種子在相同的袋 中混合。
[0027] 在一個實施例中，雄性育性基因編碼SEQ ID N0 :10的蛋白質。在一個實施例中， 雄性育性基因包括SEQ ID N0:13的核苷酸序列。在一個實施例中，雄性育性基因編碼SEQ ID N0 :14的多肽。
[0028] 在一個實施例中，雄性育性的減少或使植物雄性不育通過在相對于SEQ ID N0 :13 的第一 Met密碼子的第118位從G變為A的單個核苷酸置換來實現，得到在第37位氨基酸 處的氨基酸改變，在預測的蛋白質中從丙氨酸變為蘇氨酸。在一個實施例中，雄性育性的減 少或使植物雄性不育通過在相對于SEQ ID NO :2629的第一 Met密碼子的第119位從C變 為T的單個核苷酸置換來實現，得到在第37位氨基酸處的氨基酸改變，在預測的蛋白質中 從丙氨酸變為纈氨酸。在一個實施例中，顯性雄性育性基因可操作地連接到選自如下的啟 動子：誘導型啟動子、組織優選的啟動子、時間調節型啟動子或它們的元件。例如，啟動子優 先地驅動雄性生殖組織中的表達。
[0029] 在一個實施例中，雄性育性在育種對的雌性植物（例如，雌性自交系）中減少。
[0030] 在一個實施例中，一種植物或細胞或種子或它們的子代，其包括減少的編碼其基 因組中的SEQ ID N0 :10的第43-101位氨基酸序列的雄性育性序列，并且其中該雄性育性 基因的表達賦予顯性雄性不育性狀。
[0031] 分離的核酸分子包括能夠引發植物細胞中的轉錄的多核苷酸并且包括選自如下 的序列：SEQ ID NO :15、SEQ ID N0 :15的至少100個連續核苷酸，以及與SEQ ID N0 :15的 全長具有至少70%序列同一性的序列。在一個實施例中，表達盒或載體包括本文公開的可 操作地連接到目的多核苷酸的SEQ ID N0 :15。
[0032] 適用于本文公開的材料和方法的植物包括，例如，玉米、高粱、卡諾拉油菜、小麥、 大麥、裸麥、黑小麥、水稻、甘蔗、草坪草、珍珠粟、大豆、棉花。
[0033] 在一個實施例中，具有減少的育性或本文公開的任何其他性狀的植物任選地具有 賦予以下目的表型或性狀的一種或多種多核苷酸：營養物質吸收、氮利用效率、耐旱性、根 強度、根耐倒伏性、土壤害蟲管理、玉米根蟲抗性、除草劑耐性、抗病性、昆蟲抗性、碳水化合 物代謝、蛋白質代謝、脂肪酸代謝或植物激素生物合成。
[0034] 一種增加植物中的產量或維持產量穩定性的方法，包括通過如下方式減少雄性生 殖組織發育：在雄性生殖組織優選的啟動子的控制下表達轉基因；以及在雄性和雌性組織 同時發育期間增加分配至雌性生殖組織的營養物質。
[0035] 在一個實施例中，雄性生殖組織為穗絲。在一個實施例中，雄性生殖組織發育通過 表達可操作地連接到啟動子的基因而減少，所述啟動子包括選自列表SEQ ID NO :64-106的 序列的至少100個連續核苷酸。本文公開的啟動子序列的子集，例如，SEQ ID NO :64-70、 70-75、75-80、85-90、90-95、100-106同樣適用于驅動本文公開的目的多核苷酸的組織優選 的表達。
[0036] 在一個實施例中，在本文公開的穗絲優選的啟動子的控制下轉基因地表達目的多 核苷酸（例如，具有顯性雄性不育突變的Ms44)的植物或植物細胞或種子表現出提高的農 學參數，諸如在生殖發育期間增加分配至穗的營養物質。
[0037] -種包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸引發植物細胞中的轉錄并且 包括選自如下的序列：
[0038] 選自 SEQ ID NO :64-106 的序列；
[0039] 選自SEQ ID NO :64-106的序列的至少100個連續核苷酸，以及
[0040] 與選自SEQ ID NO :64-106的序列的全長或與其子啟動子區具有至少
[0041] 70%至約95%序列同一丨生的序列。
[0042] 在一個實施例中，在本文公開的穗絲優選的啟動子的控制下轉基因地表達目的多 核苷酸（例如，靶向涉及穗絲發育的多核苷酸的RNAi抑制序列）的植物或植物細胞或種子 表現出提高的農學參數，諸如在生殖發育期間提高分配至穗的營養物質。
[0043] 一種增加植物中產量或維持產量穩定性的方法，包括減少雄性育性，并且在雄性 和雌性組織同時發育期間增加分配至雌性生殖組織的營養物質。在一個實施例中，通過改 變遺傳雄性育性基因的表達來減少植物中的雄性育性。在一個實施例中，植物在脅迫下生 長。在一個實施例中，植物在營養物質限制條件，例如減少的可用氮下生長。
[0044] 在一個實施例中，具有減少的雄性育性并且其中營養物質在雄性和雌性組織同時 發育期間更多地分配至雌性生殖組織的植物表現出以下農學相關參數中的一者或多者：增 大的SPAD值、增加的抽穗絲、增加的穗長度、增加的穗寬度、增加的每個穗的種子數、增加 的每個穗的種子重量和增加的胚尺寸。
[0045] 在一個實施例中，具有減少的雄性育性并且其中營養物質在雄性和雌性組織同時 發育期間更多地分配至雌性生殖組織的植物在干旱脅迫下生長。在一個實施例中，通過雄 性不育來提高植物的耐旱性。
[0046] 分離的核酸分子包含以組織優選的方式引發植物細胞中的轉錄的多核苷酸，并且 包括來自以下序列的序列：
[0047] SEQ ID N0 :13、62 和 64-106 ;
[0048] SEQ ID N0 :13、62和64-106的至少100個連續核苷酸；以及
[0049] 與SEQ ID N0S :13、62和64-106的全長具有至少70%序列同一性的序列。
[0050] 在一個實施例中，一種在脅迫下增加植物中產量穩定性的方法，包括在本文公開 的穗絲優選的啟動子下表達影響雄性育性的元件從而減小在植物生殖發育階段期間對營 養物質的競爭，并且其中產量增加。
[0051] 一種在氮限制條件和/或正常氮條件下增加植物中產量或維持產量穩定性的方 法，包括減少雄性生殖組織發育并且增加在雄性和雌性組織同時發育期間分配至雌性生殖 組織的營養物質。
[0052] 在一個實施例中，雄性生殖組織為穗絲并且雄性生殖組織發育通過減少NIP3-1 或NIP3-1類蛋白質的表達來減少。在一個實施例中，NIP3-1蛋白質具有SEQ ID N0:107 的氨基酸序列。雄性生殖組織發育通過增加 SEQ ID NO :63的表達來減少。
[0053] 在一個實施例中，雄性生殖組織發育通過影響涉及穗絲形成的基因、例如無穗絲 基因的功能而減少。
[0054] 在一個實施例中，雄性生殖組織發育在用靶向基因的抑制的表達盒轉化的植物中 減少，所述基因編碼SEQ ID N0:107的氨基酸序列或與SEQ ID N0:107具有至少70%或 80 %或85 %或90 %或95 %同一性的序列。本文還公開了在T1 s 1等位基因中具有天然突變 的植物。
[0055] 在一個實施例中，啟動子優先地驅動雄性生殖組織中目的基因的表達。在一個實 施例中，啟動子為組織特異性啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子。在一個實施例中，組 織優選的啟動子為穗絲特異性啟動子。
[0056] -種包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸包括選自如下的序列：SEQ ID NO :63 ;SEQ ID N0 :63的至少100個連續核苷酸，以及與SEQ ID N0 :63的全長具有至 少70%序列同一性的序列。分離的核酸分子包括編碼TLS1蛋白質的多核苷酸，所述多核苷 酸包括SEQ ID N0:107的氨基酸序列或與SEQ ID N0:107具有至少70 %或80 %或85 %或 90 %或95%同一性的序列。
[0057] -種用于產生雄性不育雜交種子的方法，包括轉化對于具有基因構建體的顯性雄 性不育為雜合的雌性自交系，所述基因構建體包括抑制顯性雄性不育表型的元件、破壞花 粉功能的第二元件，以及任選地選擇性標記，其中在自交系中表達構建體使雄性系可育。在 一個實施例中，該方法還包括對這些雄性可育植物自花授粉并且產生為顯性雄性不育的純 合子代。該方法還包括鑒別具有雌性自交系的純合顯性雄性不育基因型的那些種子；任選 地通過與轉基因保持系雜交來增加雌性自交系，得到無構建體的100%純合顯性雄性不育 種子；以及將顯性雄性不育種子的子代與雄性親本雜交以產生對于顯性雄性不育為雜合的 雜交體并且顯示顯性雄性不育表型。
[0058] 在一個實施例中，顯性雄性不育表型由多核苷酸序列賦予，所述多核苷酸序列包 括SEQ ID N0 :15的至少100個連續核苷酸并且還包括在第109至111位的密碼子，其編碼 蘇氨酸來替代SEQ ID N0 :14的第37位的丙氨酸（由SEQ ID N0 :15編碼的氨基酸序列）。
[0059] 在一個實施例中，抑制元件包括對于SEQ ID N0 :15是特異性的啟動子反向重復序 列。在一個實施例中，反向重復序列包括SEQ ID N0 :15的至少100個連續核苷酸的功能片 段。在一個實施例中，抑制元件為設計用于抑制顯性Ms44基因在雄性不育雌性自交系中的 表達的RNAi構建體。在一個實施例中，抑制元件為以顯性方式起作用以抑制植物中Ms44 突變的顯性表型的遺傳抑制因子。任選地，如果內源的正常ms44也受到抑制元件抑制，則 構建體可包括恢復ms44基因、例如在其自身啟動子或異源啟動子控制下的ms44基因的正 常功能的元件。
[0060] 在一個實施例中，公開了從本文所公開的方法得到的植物或植物細胞或種子或植 物的子代。
[0061] 在一個實施例中，用于產生雜交種子的方法包括在雌性自交系中表達可操作地連 接到異源啟動子的適于反向重復失活的顯性雄性不育基因；用來自雄性可育植物的花粉對 雄性不育植物授粉，所述雄性可育植物包含對于異源啟動子是特異性的反向重復。在一個 實施例中，花粉包含對具有反向重復失活特異性的異源啟動子是特異性的反向重復。在一 個實施例中，顯性雄性不育基因連接至水稻5126啟動子。
[0062] 在一個實施例中，在雜交種子生產的上下文中使用的顯性雄性不育基因為以顯性 方式起作用以實現雄性不育并且任選地適于抑制以維持雄性不育雌性自交系的任何基因。 在一個實施例中，顯性雄性不育基因選自：芽孢桿菌RNA酶、DAM甲基化酶、MS41和MS42。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1-產生雄性不育雜交植物的遺傳顯性雄性不育體系的圖。已發現可利用顯性 核雄性不育基因、穗絲特異性或穗絲優選的啟動子和穗絲特異性或穗絲優選的基因中的一 種或多種的植物中的雄性育性的遺傳減少可增加穗組織發育、提高正在生長的植物中的營 養物質利用率、增加脅迫耐受性和/或增加種子度量值，最終得到提高的產量。
[0064] 圖2-MS44相關序列的比對（圖2A-C)。相同的殘基以粗體示出并且所有相似的殘 基以下劃線和斜體示出。
[0065] 圖3-利用隱性雄性不育基因產生雄性不育雜交植物的方法的圖。雌性親本和雄 性親本均具有賦予不育性的純合隱性等位基因。然而，雄性親本使恢復等位基因在構建體 內，其防止恢復等位基因通過花粉傳遞。所得的雜交種子產生雄性不育的雜交植物。
[0066] 圖4-用于利用下述顯性雄性不育基因產生雄性不育雜交種子的方法的圖：
[0067] M-對于顯性雄性不育為雜合的雌性自交系用基因構建體轉化，所述基因構建體 包括抑制顯性雄性不育的元件、破壞花粉功能的第二元件，以及任選地選擇性標記。該構造 體在自交系中的表達使植物雄性可育。
[0068] 迎-植物自花授粉以產生種子。
[0069] 4C和4D-對種子或子代棺物講行基因分型以鑒別對于顯件雄件不育為純合的那 些。
[0070] 4E-雌性自交系可通過將其與轉基因保持系雜交而增加，得到100%純合顯性雄 性不育種子。
[0071] 4E-顯性雄性不育植物由第二自交系授粉以產生對于顯性雄性不育為雜合并且表 現出顯性雄性不育表型的雜交體。
[0072] 圖5-圖5A示出了響應于氮肥力的MS44雜交體產量-試驗1。圖5B示出了響應 于氮肥力的MS44雜交體產量-試驗2。
[0073] 圖6示出了與野生型相比較的MS44雜交體穗干重（R1)。
[0074] 圖7-圖7A示出了響應于植物群體的MS44雜交體產量-試驗1。圖7B示出了響 應于植物群體的MS44雜交體產量-試驗2。
[0075] 圖8示出了 tlsl突變表型。A)來自野生型植物的穗絲。B)具有小的穗絲表型的 純合tlsl植物。C)不具有穗絲的純合tlsl植物。D)具有最嚴重表型的植物往往具有帶 長殼并且不抽穗絲的多個穗（箭頭）。E)穗表型的范圍。F)葉表型的范圍。WT=純合野 生型植物；ST =具有小的穗絲的純合tlsl植物；NT =不具有穗絲的純合tlsl植物。
[0076] 圖9示出了 tlsl的基于圖譜的克隆。
[0077] 圖10示出了 tlsl候選基因驗證。ZmNIP3_l的敲除得到tlsl表型。圖10A-具有 完整ZmNIP3-l的野生型植物。圖10B-在ZmNIP3. 1中具有Mu-插入的植物表現出tlsl表 型。
[0078] 圖11示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗絲分枝數。
[0079] 圖12示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗絲分枝長度。
[0080] 圖13示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗長度。
[0081] 圖14示出tlsl植物較不易受50ppm硼的硼毒性條件影響。圖14A-并列放置純 合tlsl植物和野生型植物，其中突變型植物看起來更高和更大。圖14B-在野生型植物中， 第二嫩的完全張開的葉的節在最嫩的完全張開的葉的節的上方延伸，然而突變型植物看起 來是正常的。圖14C-突變型的最嫩的完全張開的葉比野生型更寬。
[0082] 圖15示出了 ZmNIP3-l類似于硼通道蛋白。圖15A-系譜樹示出ZmNIP3. 1與已被 表征為硼通道蛋白的0sNIP3. 1和AtNIP5. 1(突出顯示的）密切相關。圖15B-在圖15A中 突出顯示的蛋白質序列的比對；ZmNIP3. 1與0sNIP3. 1和AtNIP5. 1的百分比同一性分別為 84. 4 和 67. 3。
[0083] 圖16-來自所選物種的Ms44序列。在該比對中，Ms44顯性多肽序列的氨基酸突變 在第42位以粗體和下劃線示出，如MS44dom等位基因中的T(SEQ ID N0:14)或Ms44-2629 等位基因中的V(SEQ ID NO :153)，其中所有其他序列在該位置具有A。
[0084] 發明詳述
[0085] 提交于2013年3月12日的PCT申請PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12 日的PCT申請PCT/US2013/30455的內容和公開內容以全文引用方式并入本文。與雄性育 性相關的方法及其實施例以引用方式并入本文。
[0086] 氮利用效率（NUE)基因影響產量并對改善氮在作物（特別是玉蜀黍）中的利用具 有實用性。氮使用效率增加可由增加的對氮肥的吸收和同化和/或對積聚的氮儲備的后續 再動員和再利用，以及植物對諸如低氮環境之類的脅迫情況的耐受性增加得到。基因可用 于改變植物的遺傳組成，從而使得它們在當前的肥料施用標準下更高產或在肥料顯著減少 或氮可用量顯著減少的情況下保持它們的產出率。在氮肥獲得受限的發展中國家和在氮使 用水平保持較高的發達國家，改善玉米中的NUE都將會增加每單位投入氮肥的玉米可收獲 產量。氮利用改善還使得能降低在農場上的投入成本，降低對氮肥生產所需的非可再生能 源的使用和依賴，以及減少氮肥生產和農業利用的環境影響。
[0087] 本發明提供了改善植物產量的方法和組合物。在一些實施例中，植物產量在脅迫， 特別是非生物脅迫，例如氮限制條件下得以改善。提高植物產量的方法包括抑制植物的育 性。植物的雄性育性可用本領域已知的任何方法來抑制，這些方法包括但不限于破壞穗絲 發育基因，或者通過利用共抑制、反義或RNA沉默或干擾來降低基因的表達。其他雄性不育 植物可通過利用遺傳雄性不育突變體來實現。
[0088] 抑制植物中的雄性育性可改善植物的氮脅迫耐受性，并且這種植物可在顯著較低 的氮肥投入的情況下保持它們的產出率和/或可表現出增加的氮肥吸收和同化和/或對積 聚的氮儲備的再動員和再利用。除了產量的總體增加外，通過減少雄性育性改善氮脅迫耐 受性還可導致根質量和/或長度增加，穗、葉、種子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改 善。因此，在一些實施例中，所述方法還包括在氮限制條件下栽培所述植物，并任選選擇表 現出對低氮水平有較大耐受性的那些植物。
[0089] 另外，提供了改善非生物脅迫下的產量的方法和組合物，該方法包括：評價耕作區 的環境條件的非生物應激源（stressor)(例如，土壤中的低氮水平），并在脅迫環境下栽培 具有減少的雄性育性的種子或植物。
[0090] 本文還提供了構建體和表達盒，所述構建體和表達盒包含可有效減少雄性育性的 核苷酸序列。
[0091] 另外的方法包括但不限于：
[0092] 一種通過增加植物中的一種或多種產量組分來增加產量的方法，包括通過影響植 物中核編碼組分的表達或活性來減少雄性育性，以及在植物生長條件下種植植物，其中該 組分表現出顯性表型。在一個實施例中，核編碼組分為具有顯性表型的雄性育性基因或雄 性不育基因。任選地，雄性育性基因或雄性不育基因為轉基因。
[0093] 正在發育的雌性生殖結構與雄性生殖結構在這些生殖結構發育期間競爭氮、碳和 其他營養物質。這在當植物以增加的氮肥水平種植時定量正在發育的玉蜀黍穗和穗絲的氮 平衡中進行說明。當玉蜀黍在較低氮肥力水平下生長時，穗的氮平衡為負，或在發育期間 當氮受限時，穗丟失氮至植物的其他部分。穗的氮平衡在提供給植物的氮肥的量增加時提 高，直到穗維持氮的正向增加直至抽穗絲。相比之下，無論種植植物的育性水平如何，穗絲 都維持正向氮平衡。穗絲和穗在生殖發育期間競爭氮，并且正在發育的穗絲對正在發育的 穗占優勢。穗和穗絲可能在發育期間競爭多個營養物質，并且競爭在脅迫條件下變得更激 烈。穗在開花之前在生殖發育期間與穗絲競爭減少了正在發育的穗在脅迫下積聚營養物質 的能力，得到具有較少籽粒的較小、發育較差的穗。更嚴重的、延長的脅迫可導致穗無法抽 穗絲（exert silk)和產生谷粒。雄性育性的遺傳減少將減少穗絲發育所需的營養物質，導 致開花時穗發育提高。遺傳雄性不育和可育近親在不同氮肥力水平下生長并且在約50%花 粉散出時取樣。雄性不育植物在兩種氮肥水平下均產生更大的穗。抽穗絲的雄性不育植物 的比例也大于可育近親植物。雖然生物量（總地上植物干重減去穗干重）在較高氮肥下生 長的植物中較大，但是雄性不育對生物量無影響。這表明雄性不育具體地對植物產生更重、 更完全發育的（抽穗絲）穗的能力的正面影響，而不影響總體營養生長。
[0094] 尚未對遺傳雄性不育衍生的雜交體進行產量實驗，因為直到最近還沒有利用該雄 性不育源產生雜交種子的適當方法。由于大多數遺傳雄性不育為隱性的，因此產生雄性不 育雜交體將需要雄性不育源回交到雜交體的兩個親本中。對于雜交體雌性親本將必須為純 合隱性（雄性不育）的并且雄性親本必須為雜合（雄性可育）的以對雄性不育1:1分離。 相比之下，顯性遺傳雄性不育MS44僅需要回交到雌性親本中以產生對雄性不育1 : 1分離 的雜交種子。顯性雄性不育在多倍體植物諸如小麥中特別有用，其中純合隱性不育的維持 更為復雜。
[0095] 已發現表達植物中顯性遺傳雄性不育基因的過程，所述植物任選地結合穗絲組織 特異性啟動子和穗絲優選的基因，以增加穗組織發育、提高正在生長的植物中的營養物質 利用率并且增加種子度量值，最終得到提高的產量。（圖1)
[0096] 遺傳雄性不育極可能產生產量響應，因為花粉發育在遺傳雄性不育突變體中 停滯得更早。大多數雄性不育突變體在花粉四分體釋放后很快就失效（Albertson and Phillips，（1981) Can. J. Genet. Cytol. 23 :195-208 (Albertson 和 Phillips，1981 年，《加拿 大遺傳學與細胞學雜志》，第23卷，第195-208頁），其出現在雌性（穗）發育的非常早的階 段。直到開花前10天才能確定CMS衍生的雄性不育，如通過與CMS穩定性相關聯的環境相 互作用所判斷的（Weider，et al.，（2009) Crop Sci. 49 :77-84 (Weider 等人，2009 年，《作物 科學》，第49卷，第77-84頁））。穗的主體發育將發生在開花前10天之前。然而，當穗在早 期發育階段時，遺傳雄性不育的早期停滯將是減少正在發育的穗與穗絲發育對營養物質的 競爭的一種方法。與通過提高穗發育引導的雄性不育雜交體相關聯的產量提高與穗發育和 穗絲發育競爭的減少一致。
[0097] 在恢復的（雄性可育）和未恢復的（雄性不育）細胞質雄性不育（CMS)雜交體中 測試對氮肥力的產量響應。一個雜交體在開花期間由于環境條件變為雄性可育，而另一個 雜交體由于雄性不育未表現出顯著的產量效應。這些結果表明通過細胞質基因確定的雄性 不育可能直到穗絲和穗發育的較晚期才能確定，如通過與CMS穩定性相關聯的環境相互作 用所判斷的。穗的主體發育已在確定CMS雄性不育之前（開花前10天）發生，從而在穗發 育期間提供極少減輕的穗絲競爭。因此在遺傳雄性不育中的穗絲發育將在較長的穗發育時 間段期間減少，并因此與穗發育競爭較少。遺傳雄性不育突變體不受環境條件的顯著影響。
[0098] 減輕正在發育的穗絲和穗之間的競爭還可通過化學誘導雄性不育來實現?；?學物質和遺傳操縱的組合也可誘導雄性不育。通過雄性生殖組織中具有較低功效的啟 動子或通過使用殺配子劑前體（pro-gametocide) (Dotson, et al·，（1996)The Plant Journal 10 :383-392 ((Dotson 等人，1996 年，《植物雜志》，第 10 卷，第 383-392 頁）和 (Mayer and Jefferson, (2004)Molecular Methods for Hybrid Rice Production(Mayer 和Jefferson，2004年，《用于雜交水稻生產的分子方法》））來修改除草劑耐性。組織特異 性方式的抑制劑也將是實施本發明的有效方法。
[0099] 在多種情況下，特定的植物性狀通過維持純合隱性條件來表達。當轉基因恢復基 因必須用于維持時，需要另外的步驟來維持純合條件。例如，玉蜀黍中的MS45基因（美國 專利No. 5, 478, 369)有助于雄性育性。由于MS45育性性狀的孢子體性質，因此顯性MS45 等位基因的雜合或半合植物是完全可育的。MS45基因中指定為ms45的天然突變在該突變 型等位基因處于純合狀態時賦予植物雄性不育表型。當通過普通雜交或轉基因互補方法將 非突變形式的基因引入植物中時，此不育性可逆轉（即，育性被恢復）。然而，通過雜交對育 性的恢復移除了所需的純合隱性條件，并且兩種方法都恢復了全部雄性育性并且阻止了對 純的雄性不育母系的維持。
[0100] 維持所需的純合隱性條件的方法在美國專利No. 7, 696, 405和7, 517, 975中有所 描述，其中保持系用于雜交到純合隱性雄性不育姊妹體上。保持系在雄性不育所需的純合 隱性條件下，而且還包含由顯性雄性育性基因組成的半合轉基因構建體以補充雄性不育條 件；花粉消融基因，其阻止通過轉基因構建體的花粉轉移至雄性不育姊妹體，但允許隱性雄 性不育等位基因通過非轉基因花粉粒的轉移；以及種子標記基因，其允許對轉基因保持系 種子或植物和轉基因無效雄性不育種子或植物進行分選。
[0101] 制種技術（SPT)提供了維持植物中雄性不育基因的純合隱性條件的方法。參見 (例如）美國專利No. 7, 696, 405。SPT將為花粉源的保持系用于其純合隱性雄性不育姊妹體 的受精。保持系在雄性不育所需的純合隱性條件下，而且還包含半合轉基因構建體（"SPT 構建體"）。在某些實施例中，SPT構建體包含以下三種元件：（1)顯性雄性育性基因，以補 充雄性不育隱性條件；（2)編碼干擾雄性配子的形成、功能或傳播的產物的基因和（3)標記 基因，其允許從那些不含該轉基因的種子/植物中分選該轉基因保持系種子/植物。對花 粉的形成、功能或傳播的干擾阻止了通過轉基因構建體的花粉轉移；功能性花粉不含該轉 基因。所得的種子產生為雄性不育的植物。然后將這些雄性不育自交系植物用于通過用雄 性親本授粉的雜交體生產，所述雄性親本對于雄性育性基因的顯性等位基因可為不相關的 自交系純合體。所得的雜交種子產生為雄性可育的植物。
[0102] 要產生雜交雄性不育子代，雄性親本將用作保持系以雜交到雄性不育雌性自交系 上（利用單獨的雌性保持系增加）以得到完全雄性不育的雜交植物。參見（例如）圖3。
[0103] 使用顯性方法是實現雄性不育或減少的雄性育性的另一種方法。顯性雄性不育方 法優于隱性雄性不育的使用，因為完全不育僅需要顯性基因的單拷貝。然而，如果方法不可 用于產生純合顯性雄性不育系，那么所得的子代將對雄性不育50%分離。該情況可通過轉 基因地將篩選性或選擇性標記連接到顯性雄性不育基因并且篩選或選擇攜帶標記的子代 種子或植物來減輕。對于顯性雄性不育等位基因，連接的遺傳標記或連接的表型可用于分 選子代。描述可逆顯性雄性不育體系的方法在將化學物質施加于顯性雄性不育植物的美國 專利No. 5, 962, 769中有所描述，所述可逆顯性雄性不育體系逆轉表型并且得到雄性育性， 從而允許自花授粉使得可獲得純合顯性雄性不育植物?？深A想用于產生純合顯性雄性不育 植物的其他方法，所述方法使用控制抑制或干擾顯性雄性不育基因功能的基因的誘導型啟 動子。植物為組成型不育的，僅當啟動子被誘導時變為可育的，從而允許破壞顯性雄性不育 基因功能的阻遏子的表達。阻遏子可為靶向顯性雄性不育基因自身或其啟動子或能夠結合 顯性雄性不育基因產物或使其失活的基因產物的反義基因、RNAi、反向重復序列。
[0104] 另一個在顯性雄性不育的子代中產生100%雄性不育的方法將使用自動剪接蛋白 質序列。自動剪接蛋白質序列為能夠自行切除并且以肽鍵重新結合剩余的一個或多個部 分的蛋白質片段。自動剪接蛋白質序列可自剪接并且將剩余部分歸為順式和反式兩種狀 態。顯性雄性不育基因可進行修飾使得對N和C蛋白質區域編碼的區域被分成不同的轉基 因構建體，與對自動剪接蛋白質序列編碼的序列結合。由于蛋白質為截短和無功能的，所以 包含單個構建體的植物將為雄性可育的，其允許自體受精以產生純合植物。然后可將對于 N-DMS-N-自動剪接蛋白質序列為純合的植物與對于C-自動剪接蛋白質序列-C-DMS蛋白質 為純合的植物雜交。所有來自此雜交的子代通過切除每個自動剪接蛋白質序列以及N和C 序列的歸類將為雄性不育的，以產生功能性的顯性雄性不育蛋白質。
[0105] 一系列田地實驗用于定量在各種環境變量下遺傳雄性不育的產量響應。使用兩個 變量：施氮量和植物密度，以使植物經受各種程度的脅迫。脅迫處理的連續性由于對遺傳雄 性不育植物的穗的更大程度的同化物分配，允許對植物性能的清晰分離。這些方法用于定 量和說明田地中代表性的作物冠層環境中的正向產量效應。這些數據驗證了在溫室研究中 測量的早期單個植株響應。
[0106] 雄性不育表現為在特定植物組織的發育中的變化。玉蜀黍穗和穗絲為共享共同的 發育過程并且受共同的一組基因控制的兩種花序結構。組織彼此競爭所需的營養物質。然 而穗絲具有優于穗的頂端優勢的優點，其不利于玉蜀黍植物中的穗生長和產量潛力。減小 穗絲頂端優勢可用于將更多資源轉向穗生長、籽粒數量或尺寸，并且最終可得到增加的谷 粒產量。
[0107] 有多種方法減少穗絲的競爭，諸如雄性不育、穗絲尺寸減少或穗絲消除（無穗絲 玉蜀黍植物）。當基因的遺傳突變（突變體）諸如雄性不育基因可用于減少穗絲與穗的競 爭時，轉基因操作提供用于此目的的替代方案或使能工具。由于涉及穗絲發育的基因通常 涉及穗發育，所以通過中斷這些基因減少穗絲發育也可影響穗發育。無穗絲基因（Tsll)突 變為其中無穗絲植物也是無穗的例子。要使穗絲生長減少而不干擾穗發育，則需要穗絲特 異性啟動子靶向僅在穗絲組織中的基因破壞。
[0108] 提到的所有參考文獻均以引用方式并入本文。
[0109] 除非另外明確定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有本發明所屬領域 的普通技術人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術 是本領域普通技術人員所熟知的標準方法。材料、方法和實例僅為示例性的而不是限制性 的。以下內容以舉例說明的方式給出，而非意在限制本發明的范圍。
[0110] 借助前面的描述和隨附的附圖中給出的教導，這些公開內容所屬領域的技術人員 將會想到本文所述公開內容的許多修改形式和其他實施例。因此，應當了解，這些公開內容 不限于所公開的特定實施例，并旨在將修改形式和其他實施例包括在本文末尾所附權利要 求的范圍內。雖然本文中采用特定術語，但所述術語僅在一般性和描述性意義上使用而并 非用于限制目的。
[0111] 除非另外指明，否則本發明的實施將采用植物學、微生物學、組織培養、分子生物 學、化學、生物化學和重組DNA技術的常規技術，這些技術處于本領域技能范圍內。
[0112] 單位、前綴和符號可以它們SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5'到3'的 方向從左向右書寫；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左向右書寫。數值范圍包括限定 該范圍的數字。氨基酸在本文中可通過它們通常知道的三字母符號表示或通過IUPAC-IUB 生化命名委員會（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號 表示。同樣，核苷酸可通過它們通常接受的單字母密碼表示。下面定義的術語通過參考本 說明書整體進行更完整的定義。
[0113] 在描述本發明時，將采用下面的術語，并采用下文所示的定義。
[0114] 所謂"微生物"意指任何微生物（包括真核微生物和原核微生物），諸如真菌、酵 母、細菌、放線菌、藻類和原生動物以及其他單細胞結構。
[0115] 所謂"擴增"意指構建核酸序列的多個拷貝或與該核酸序列互補的多個拷貝，該構 建是利用所述核酸序列中的至少一者作為模板進行。擴增系統包括聚合酶鏈式反應（PCR) 系統、連接酶鏈式反應（LCR)系統、基于核酸序列的擴增（安大略省米西索加市加拿大基 因公司（Cangene，Mississauga, Ontario))、〇-β復制酶系統、基于轉錄的擴增系統（TAS) 和鏈置換擴增（SDA)。參見例如 Diagnostic Molecular Microbiology 〖Principles and Applications,Persing,et al. ，eds. ，American Society for Microbiology,Washington, DC(1993)(《診斷分子微生物學：原理和應用》，Persing等人編輯，美國微生物學會，華盛頓 特區，1993年）。擴增的產物稱為擴增子。
[0116] 術語"保守修飾的變體"同時適用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列 而言，保守修飾的變體指編碼氨基酸序列的相同的或保守修飾的變體的那些核酸。由于遺 傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG 和GCU全部編碼丙氨酸這種氨基酸。因而，在每個由密碼子規定丙氨酸的位置，可將該密碼 子變更為所描述的相應密碼子的任一種而不會改變所編碼的多肽。這種核酸變異為"沉默 變異"，代表保守修飾變異的一種。編碼多肽的本文每種核酸序列還描述了該核酸的每種可 能的沉默變異。普通技術人員將認識到，核酸中的每個密碼子（除了 AUG，它通常是甲硫氨 酸的唯一密碼子；一個例外是微球菌（Micrococcus rubens)，對于它來說GTG是甲硫氨酸 密碼子（Ishizuka，et al.，（1993) J. Gen. Microbiol. 139 :425-32 (Ishizuka 等人，1993 年， 《普通微生物學雜志》，第139卷，第425-432頁））可進行修飾以產生功能上相同的分子。因 此，編碼本發明多肽的核酸的每種隱匿的變異均隱含在每種所描述的多肽序列中并以引用 的方式并入本文。
[0117] 對于氨基酸序列，技術人員將認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列作出的會改 變、添加或缺失所編碼的序列中的單個氨基酸或一小部分氨基酸的各個置換、缺失或添加， 在該變更導致氨基酸為化學類似的氨基酸所置換時，為"保守修飾的變體"。因而，還可變 更選自1至15的整數的任何數目的氨基酸殘基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10個 變更。保守修飾的變體通常提供與它們所源自的未經修飾的多肽序列類似的生物活性。例 如，對于其天然底物而言，底物特異性、酶活性或配體/受體結合通常為天然蛋白質的至少 30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，優選60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守 置換表是本領域所熟知的。
[0118] 下面的六個組各含有對彼此而言是保守置換的氨基酸：
[0119] 1)丙氨酸（A)、絲氨酸⑶、蘇氨酸（T);
[0120] 2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E);
[0121] 3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q);
[0122] 4)精氨酸（R)、賴氨酸（K);
[0123] 5)異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、繳氨酸（V);和
[0124] 6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0125] 還可參見 Creighton，Proteins，W. H. Freeman and Co. (1984) (Creighton，《蛋白 質》，W. H. Freeman 公司，1984 年）。
[0126] 如本文所用，"基本上由...組成"意指在如下情況下目標多核苷酸或多肽可包 括額外的序列：額外的序列不會嚴重影響受權利要求保護的多核苷酸或多肽序列的基本功 能。
[0127] 術語"構建體"用來主要指多核苷酸序列的人工組合，即在自然界中不會發生的、 通常包含一個或多個調節元件和一個或多個編碼序列的組合。該術語可包括指表達盒和/ 或載體序列，視上下文而定。
[0128] "對照"或"對照植物"或"對照植物細胞"提供度量其中已針對目的基因實現了遺 傳變更（如轉化）的受試植物或植物細胞的表型變化的參考點。受試植物或植物細胞可從 作了如此變更的植物或細胞遺傳而來，且會包含該變更。
[0129] 對照植物或植物細胞可例如包括：（a)野生型植物或細胞，即具有與用于進行遺 傳變更的起始材料相同的基因型的植物或細胞，該遺傳變更會得到受試植物或細胞；(b) 具有與起始材料相同的基因型但已用無效構建體（即，用對所關注性狀不具有已知效果的 構建體，諸如包含標記基因的構建體）轉化的植物或植物細胞；（c)為受試植物或植物細胞 的子代中的非轉化分離子的植物或植物細胞；（d)遺傳上與受試植物或植物細胞相同但未 暴露于會誘導所關注基因表達的條件或刺激的植物或植物細胞；或者（e)處于其中所關注 基因不表達的條件下的受試植物或植物細胞本身。對照植物還可以是用另選的下調構建體 轉化的植物。
[0130] 就指定的核酸而言，所謂"編碼"意指包含翻譯成指定蛋白質的信息。編碼蛋白 質的核酸可以包含在該核酸的翻譯區內的非翻譯序列（例如內含子）或可以缺少這種居 間的非翻譯序列（例如，如在cDNA中）。據以編碼蛋白質的信息是通過使用密碼子來確定 的。通常，氨基酸序列由核酸利用"通用"遺傳密碼來編碼。然而，可使用如在某些植物、動 物和真菌線粒體、細菌山羊支原體（Mycoplasma capricolum) (Yamao，et al.，（1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :2306-9 (Yamao等人，1985年，《美國國家科學院院刊》，第82卷，第 2306-2309頁）），或纖毛蟲大核（ciliate Macronucleus)中存在的通用密碼的變體，當用 這些生物體表達該核酸時。
[0131] 當通過合成法制備或改變核酸時，可利用將在其中表達核酸的預期宿主的已知密 碼子偏好性。例如，盡管本發明的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表 達，但可對序列進行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量 偏好性，因為這些偏好性已被證實不同（Murray，et al.，（1989)Nucleic Acids Res. 17: 477-98 (Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498頁），將其以引用的方式并 入本文）。因而，具體氨基酸的玉蜀黍優選密碼子可由來自玉蜀黍的已知基因序列得出。關 于來自玉蜀黍植物的28種基因的玉蜀黍密碼子使用在Murray等人（出處同上）的表4中 列出。
[0132] 如本文所用，針對核酸的"異源"為起源于外來物種的核酸，或者，如果起源于相同 物種的話，則為通過蓄意的人為干預對其天然形式在組成和/或基因組基因座方面進行了 實質性修飾的核酸。例如，可操作地連接至異源結構基因的啟動子是來自不同于衍生該結 構基因的物種的物種，或者如果是來自相同的物種，則對一者或二者由其初始形式進行了 實質性的修飾。異源蛋白質可起源于外來物種，或者，如果起源于相同物種，則通過蓄意的 人為干預對其天然形式進行了實質修飾。
[0133] 所謂"宿主細胞"意指包含本發明的異源核酸序列、含有載體并能支持該表達載體 的復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌（E.coli)，或真核細胞如 酵母、昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細胞。優選地，宿主細胞是單子葉植物細胞或雙子葉 植物細胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、卡諾拉油菜、 大麥、小米和番茄。特別優選的單子葉宿主細胞是玉米宿主細胞。
[0134] 術語"雜交復合體"包括指由兩條相互選擇性雜交的單鏈核酸序列形成的雙鏈核 酸結構。
[0135] 在將核酸插入細胞的語境中，術語"引入"意指"轉染"或"轉化"或"轉導"，包括 指將核酸并入真核或原核細胞中，其中該核酸可并入細胞的基因組（例如染色體、質粒、質 體或線粒體DNA)中，轉化成自主復制子或瞬時表達（例如，轉染的mRNA)。
[0136] 術語"分離的"指諸如核酸或蛋白質之類的物質，該物質實質上或基本上不含在其 天然存在的環境中發現的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。術語"非天然存在的"、 "突變的"、"重組的"、"重組表達的"、"異源的"或"異源表達的"為不存在于其天然存在環境 中的代表性生物材料。
[0137] 術語"NUE核酸"意指包含編碼完全長度或部分長度多肽的多核苷酸（"NUE多核 苷酸"）的核酸。
[0138] 如本文所用，"核酸"包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質的已知類似物：其 以與天然存在的核苷酸（例如肽核酸）相似的方式雜交至單鏈核酸。
[0139] 所謂"核酸文庫"意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含且實質上代表指定生 物體的基因組的整個被轉錄的部分。示例性核酸文庫如基因組文庫和cDNA文庫的構建， 在諸如以下的標準分子生物學參考文獻中有教導：Berger and Kimmel，（1987)Guide To Molecular Cloning Techniques, from the series Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc·, San Diego, CA (Berger 和 Kimmel，1987 年，《分子克隆技術指南》， 來自《酶學方法》系列第152卷，學術出版社，加州圣地亞哥）；Sambrook，et al.，（1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2nd ed.，vols. l-3(Sambrook等人，1989年，《分 子克隆實驗指南》，第 2 版，第 1-3 卷）；以及 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,et al. ,eds,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley&Sons，Inc. (1994Supplement)(《最新分子生物學實驗方 法匯編》，Ausubel等人編輯，選自《實驗室指南》，格林出版聯合公司與約翰威立父子出版公 司的合資公司（1994年增刊））。
[0140] 本文所用的"可操作地連接"包括指涉第一序列（諸如啟動子）和第二序列之間 的功能性連接，其中啟動子序列起始并介導對應第二序列的DNA的轉錄。一般來講，可操作 地連接意指被連接的核酸序列是連續的，并且如果有必要連接兩個蛋白質編碼區的話，是 連續的且在相同的閱讀框內。
[0141] 如本文所用，術語"植物"包括指整個植株、植物器官（例如葉、莖、根等）、種子和 植物細胞和它們的子代。如本文所用，植物細胞包括但不限于種子、懸浮培養物、胚、分生組 織區、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子?？捎糜诒景l明方法的植物種類 通常與適用于轉化技術的高等植物種類一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括以 下屬的種：南瓜屬（Cucurbita)、薔薇屬（Rosa)、葡萄屬（Vitis)、胡桃屬（Juglans)、草莓 屬（Fragaria)、百脈根屬（Lotus)、苜猜屬（Medicago)、驢食草屬（Onobrychis)、三葉草屬 (Trifolium)、胡蘆巴屬（Trigonella)、紅豆屬（Vigna)、柑桔屬（Citrus)、亞麻屬（Linum)、 老鶴草屬（Geranium)、木薯屬（Manihot)、胡蘿卜屬（Daucus)、擬南芥屬（Arabidopsis)、 蕓苔屬（Brassica)、蘿卜屬（Raphanus)、白芥屬（Sinapis)、顛爺屬（Atropa)、辣椒屬 (Capsicum)、曼陀羅屬（Datura)、天仙子屬（Hyoscyamus)、番爺屬（Lycopersicon)、煙 草屬（Nicotiana)、爺屬（爺屬）、碧冬爺屬（Petunia)、毛地黃屬（Digitalis)、馬珠草 屬（Majorana)、菊苣屬（Ciahorium)、向日葵屬（Helianthus)、萵苣屬（Lactuca)、雀麥 屬（Bromus)、天門冬屬（Asparagus)、金魚草屬（Antirrhinum)、萱草屬（Heterocallis)、 Nemesis、天竺葵屬（Pelargonium)、黍屬（Panieum)、狼尾草屬（Pennisetum)、毛茛屬 (Ranunculus)、千里光屬（Senecio)、蛾蝶花屬（Salpiglossis)、黃瓜屬（Cucumis)、布洛 華麗屬（Browaalia)、大豆屬（Glycine)、豌豆屬（Pisum)、菜豆屬（Phaseolus)、黑麥草 屬（Lolium)、稻屬（Oryza)、燕麥屬（Avena)、大麥屬（Hordeum)、黑麥屬（Secale)、蔥屬 (Allium)和小麥屬（Triticum)。特別優選的植物是玉米（Zea mays)。
[0142] 本文所用的"產量"可包括指收獲時每英畝谷類作物的蒲式耳數目（針對谷粒水 分進行了調整，例如玉蜀黍的水分通常為15% )，和指所產生的生物量的體積（對于草料作 物諸如苜蓿而言，以及復種作物的植株根尺寸）。谷粒水分是在收獲時的谷粒中測量。谷粒 的經調整的測試重量確定為針對收獲時的谷粒水分水平進行了調整的重量，單位磅/蒲式 耳。生物量測量為所產生的可收獲植物材料的重量。
[0143] 如本文所用，"多核苷酸"包括指脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或它們的類似 物，所述類似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性質：在嚴格雜交條件下其所雜交 的核苷酸序列與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻譯成與天 然存在的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結構基因或調 控基因的全長序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術語包括指指定的序列及其互補序 列。
[0144] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這 些術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物 的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0145] 本文所用的"啟動子"包括指DNA的在轉錄起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋 白質的識別和結合以起始轉錄的區域。"植物啟動子"是能夠引發在植物細胞中的轉錄的啟 動子。示例性的植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細胞中表達的基 因的細菌獲得的那些啟動子，所述細菌如農桿菌（Agrobacterium)或根瘤菌（Rhizobium)。 例子為優先起始在某些組織，例如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞或厚壁組織中的轉 錄的啟動子。這種啟動子被稱為"組織優選的"。"細胞類型"特異性啟動子主要驅動在一 個或多個器官中某些細胞類型中的表達，例如根或葉中的維管細胞。"誘導型"或"調控型" 啟動子是處于環境控制下的啟動子?？赏ㄟ^誘導型啟動子影響轉錄的環境條件的例子包括 無氧條件或光的存在。另一類型的啟動子是發育調節啟動子，例如在花粉發育過程中驅動 表達的啟動子。組織優選的、細胞類型特異性的、發育調節的和誘導型的啟動子構成了"非 組成型"啟動子類別。"組成型"啟動子為在發育或細胞分化的大多數環境條件和狀態下， 在植物的基本上所有組織中都有活性的啟動子。
[0146] 術語"多肽"指一條或多條氨基酸序列。該術語還包括其片段、變體、同源物、等位 基因或前體（例如原前蛋白或前蛋白）。"NUE蛋白質"包含多肽。除非另有規定，否則術語 "NUE核酸"意指包含編碼多肽的多核苷酸（"NUE多核苷酸"）的核酸。
[0147] 如本文所用，"重組的"包括指已通過引入異源核酸進行修飾的細胞或載體，或者 源于經這樣修飾過的細胞的細胞。因而，例如，重組細胞表達不以天然（非重組）形式的細 胞內的相同形式存在的基因，或因為有意人為干預而表達原本異常表達、表達不足或根本 不表達的天然基因，或可具有減低的或消除的天然基因表達。本文所用的術語"重組的"不 涵蓋通過天然發生的事件（例如自發突變、天然轉化/轉導/轉座）進行的細胞或載體的 變更，所述事件為例如在沒有蓄意人為干預的情況下發生的那些。
[0148] 本文所用的"重組表達盒"是具有一系列規定核酸元件的通過重組法或合成法產 生的核酸構建體，其允許特定核酸在靶細胞中轉錄?？蓪⒅亟M表達盒摻入到質粒、染色體、 線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了別的序列以外，表達載體的重組表達 盒部分還包含待轉錄的核酸和啟動子。
[0149] 術語"選擇性雜交"包括指在嚴格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交 的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測地更高（例如，至少2倍于背景），并且基本上排 除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少40%的序列同一性，優選60-90%的 序列同一'I"生，最優選1〇〇%的序列同一'I"生（即互補性）。
[0150] 術語"嚴格條件"或"嚴格雜交條件"包括指探針與其靶序列雜交的程度將比它與 其他序列雜交的程度可檢測地更高（例如，至少2倍于背景）的條件。嚴格條件是序列依 賴性的，并且將在不同環境下不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒別與探針 可最高達100%互補的靶序列（同源探測）?；蛘?，可以調節嚴格性條件以允許序列中的一 些錯配，從而檢測到較低程度的相似性（異源探測）。優選地，探針長為大約500個核苷酸， 但長度可變化很大，從小于500個核苷酸到等于靶序列的整個長度。
[0151] 通常，嚴格條件將為其中鹽濃度低于約1. 5M鈉離子，通常為約0. 01至1. 0M鈉離 子濃度（或其他鹽），pH為7. 0至8. 3,對短探針（例如，10至50個核苷酸）而言溫度為 至少30°C，對長探針（例如超過50個核苷酸）而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴 格條件還可通過添加去穩定劑如甲酰胺或Denhardt' s來實現。示例性的低嚴格性條件 包括在用30%至35%甲酰胺、1M NaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉）的緩沖溶液37°C下雜 交，并在IX至2X SSC(20X SSC = 3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉）中在50°C至55°C下洗 滌。示例性的中等嚴格性條件包括37°C下在40至45%甲酰胺、1M NaCl、l%SDS中雜交， 并在55至60°C下在0. 5X至IX SSC中洗滌。示例性的高嚴格性條件包括在50%甲酰胺、 1M NaCl、l%SDS中在37°C下雜交和在0. IX SSC中在60至65°C下洗滌。特異性通常決 定于雜交后的洗滌，關鍵因素為最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，T m 可根據 Meinkoth and Wahl，（1984)，Anal. Biochem.，138 :267-84(Meinkoth 和 Wahl，1984 年，《分析生物化學》，第138卷，第267-284頁）中的1 = 81.51：+16. 6 (log M)+0.41(% GC)-〇. 61 (% form)-500/L來大致估計；其中Μ為單價陽離子的摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥 嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體 的長度（單位為堿基對）。TmS50%的互補靶標序列與完美匹配的探針雜交時的溫度（在 確定的離子強度和pH下）。每1 %的錯配，Tm降低約1 °C ;因此，可調節Tm、雜交和/或洗滌 條件以雜交至所需同一性的序列。例如，如果尋求具有> 90%同一性的序列，則可將Tm降 低l〇°C。通常，將嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列在確定的離子強度和pH下的熱 解鏈溫度（T m)低約5°C。然而，極端嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度（Tm)低1、2、3或4°C 的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度（Tm)低6、7、8、9或10°C的雜交和 /或洗滌；低嚴格條件可以采用比熱解鏈溫度（T m)低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/ 或洗滌。利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術人員將認識到，雜交和/或 洗滌溶液的嚴格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯配程度導致^低于45°C (水 溶液）或32°C (甲酰胺溶液），則優選增加 SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關核 酸的雜交的詳盡指南見于以下文獻：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, " Elsevier, New York(1993) (Tijssen,《生物化學和分子生物學實驗室技術-核 酸探針雜交》，第I部分，第2章，"核酸探針測定法的雜交原理和策略概覽"，Elsevier出版 社，紐約，1993 年）；以及 Current Protocols in Molecular Biology，chapter2，Ausubel， et al. , eds, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(1995)(《最新分 子生物學實驗方法匯編》，第2章，Ausubel等人編輯，格林出版公司與約翰威立出版公 司，紐約，1995年）。除非另有規定，否則在本專利申請中，高嚴格性定義為在4X SSC、5X DenhardC s(5g Ficoll，5g聚乙烯批咯燒酮，5g牛血清白蛋白于500mL水中）、0· lmg/mL 煮沸的鮭精DNA和25mM磷酸鈉中在65°C下雜交，和在0. IX SSC、0. 1% SDS中在65°C下洗 滌。
[0152] 如本文所用，"轉基因植物"包括指在其基因組內包含異源多核苷酸的植物。一般 來講，異源多核苷酸穩定地整合在基因組內使得該多核苷酸得以傳遞到連續世代。異源多 核苷酸可單獨整合進基因組中，或者作為重組表達盒的一部分整合進基因組中。"轉基因" 在本文中用來包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細胞、細胞系、愈傷組織、 組織、植物部分或植物，包括那些最初如此變更的轉基因以及那些通過從最初的轉基因進 行有性雜交或無性繁殖而產生的轉基因在內。本文所用的術語"轉基因"不涵蓋通過常規 植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或 自發突變之類的自然發生事件導致的基因組（染色體基因組或染色體外基因組）的改變。
[0153] 如本文所用，"載體"包括指用于轉染宿主細胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。 載體常常是復制子。表達載體允許插入其中的核酸轉錄。
[0154] 以下術語用于說明兩個或更多個核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關系：(a) "參 考序列"、（b) "比較窗口"、（c) "序列同一性"、（d) "序列同一性百分數"和（e) "基本上全 同"。
[0155] 如本文所用，"參考序列"是用作序列比較基準的確定的序列。參考序列可以是指 定序列的子集或全部；例如全長cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0156] 如本文所用，"比較窗口 "意指包括指多核苷酸序列的連續和指定的區段，其中該 多核苷酸序列可與參考序列進行比較，并且其中該比較窗口中的該多核苷酸序列部分相比 于參考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即空位），以便兩個多核苷酸的最佳 比對。通常，比較窗口長度為至少20個連續的核苷酸，任選可為30、40、50、100個或更長。 本領域技術人員認識到，為避免由于在多核苷酸序列中納入空位所致的與參考序列的高度 相似性，通常引入空位罰分并從匹配數扣除空位罰分。
[0157] 將核苷酸和氨基酸序列進行比對以作比較的方法是本領域公知的。局部同源性算 法（BESTFIT)(Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2 :482(Smith 和 Waterman,1981 年，《應用數學進展》，第2卷，第482頁））可以對用于比較的序列進行最佳比對；Needleman and Wunsch，（1970) J. Mol. Biol. 48 :443-53 (Needleman 和 Wunsch，1970 年，《分子生物學雜 志》，第48卷，第443-453頁）的同源性比對算法（GAP);相似性搜索方法（Tfasta和Fasta) (Pearson and Lipman, (1988)Proc. Natl. Acad. Sci.USA85 :2444 (Pearson 和 Lipman, 1988 年，《美國國家科學院院刊》，第85卷，第2444頁））；這些算法的計算機化實施包括，但不限 于：Intelligenetics (加州山景城（Mountain View，California))的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software 卩3淡3§6*第 8 版（可得自 Genetics Computer Group(GCG* 程序（Accelrys 公司（加州圣地亞哥（San Diego，CA)))中的 GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下文獻詳細說明：Higginsh and Sharp，（1988) Gene73 :237-44 (Higgins 和 Sharp，1988 年，《基因》，第 7 卷，第 237-244 頁）；Higgins and Sharp，（1989) CABI0S5 :151-3 (Higgins和Sharp，1989年，《計算機在生物科學中的應用》， 第 5 卷，第 151-153 頁）；Corpet，et al.，（1988)Nucleic Acids Res.l6:10881_90(Corpet 等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第 10881-10890 頁）；Huang，et al.，（1992) Computer Applications in the Biosciences8 :155-65 (Huang 等人，1992 年，《計算機在生物科學 中的應用》，第 8 卷，第 155_165 頁）以及 Pearson et al·，（l994)Meth.Mol.Biol.，24: 307-31 (Pearson等人，1994年，《分子生物學方法》，第24第307-310頁）。用于多個序 列的最佳全局比對的優選程序是 PileUp(Feng and Doolittle, (1987) J.Mol.Evol.，25: 351-60 (Feng和Doolittle，1987年，《分子進化學雜志》，第25卷，第351-360頁），其類似于 Higgins and Sharp，（1989) CABI0S5 :151-53 (Higgins 和 Sharp，1989 年，《計算機在生物科 學中的應用》，第5卷，第151-153頁）中描述的方法，將文獻以引用的方式并入本文?？捎糜?數據庫相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數據 庫序列進行查詢；BLASTX，用于核苷酸查詢序列針對蛋白質數據庫序列進行查詢；BLASTP， 用于蛋白質查詢序列針對蛋白質數據庫序列進行查詢；TBLASTN，用于蛋白質查詢序列針對 核苷酸數據庫序列進行查詢；以及TBLASTX，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數據庫序列 進行查詢° 參見 Current Protocols in Molecular Biology, Chapterl9,Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley_Interscience，New York(1995)(《現代分子生物學實驗技 術》，第19章，Ausubel等人（編輯），威利-英特科學出版公司，紐約，1995年）。
[0158] GAP利用Needleman和Wunsch(出處同上）的算法來尋找兩個完整序列的比對，該 比對使匹配數最大而使空位數最小。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并產生具有最大 數目的匹配堿基和最少的空位的比對。它允許提供以匹配堿基數為單位的空位產生罰分和 空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，必須利用匹配的空位產生罰分數。如果選擇大 于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。 Wisconsin Genetics軟件包第10版中的默認空位產生罰分值和空位延伸罰分值分別為8 和2?？瘴划a生和空位延伸罰分可以以選自0-100的整數來表示。因而，例如，空位產生和 空位延伸罰分可以是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50 或更大。
[0159] 如本領域普通技術人員將會理解的，BLAST搜索假定蛋白質可以隨機序列建模。然 而，許多真實蛋白質包含非隨機序列區，該非隨機序列可為同聚段、短周期重復或富含一種 或多種氨基酸的區域。這種低復雜性區域可在不相關的蛋白質之間比對，盡管該蛋白質的 其他區域完全不相似?？刹捎枚喾N低復雜性過濾程序來減少這種低復雜性比對。例如，可單 獨使用或聯合使用 SEG(Wooten and Federhen，（1993)Comput.Chem. 17 :149-63 (Wooten 和 Federhen，1993 年，《計算化學》，第 17 卷，第 149-163 頁））和 XNU(Claverie and States, (1993)Comput. Chem. 17 :191-201 (Claverie 和 States，1993 年，《計算化學》，第 17 卷，第 191-201頁））低復雜性過濾程序。
[0160] 在兩條多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的"序列同一性"或"同一性"是指 當在指定的比較窗口上進行比對以獲得最大對應時兩個序列中相同的殘基。當序列同一性 百分數針對蛋白質使用時，認識到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中 氨基酸殘基由具有相似化學性質（例如電荷或疏水性）的其他氨基酸殘基置換，因此不會 改變分子的功能性質。如果序列差別在于保守置換，則可上調百分比序列同一性以校正置 換的保守性質。差別在于這種保守置換的序列被說成具有"序列相似性"或"相似性"。作出 這個調節的方法是本領域技術人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換評定為部分錯配而 不是完全錯配，從而增加序列同一性百分數。因而，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保 守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分數。例如，根據Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :ll_17(Meyers 和 Miller，1988 年，《計算機在生物科學中的 應用》，第4卷，第11-17頁）的算法計算保守置換的分數，例如如在程序PC/GENE (美國加利 福尼亞州山景城 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California, USA))中所實現的。
[0161] 本文所用的"序列同一性百分數"意指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序 列所確定的數值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參考序列（不包含添加或缺 失）相比包含添加或缺失（即空位），以便兩個序列的最佳比對。該百分數是這樣計算的： 確定在兩個序列中出現相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數目以得到匹配的位置的數 目，將匹配的位置的數目除以比較窗口中的位置的總數目，然后將結果乘以100以得到序 列同一性百分數。
[0162] 術語多核苷酸序列的"基本上相同"意指利用所描述的比對程序之一采用標準參 數與參考序列比較時，多核苷酸包含具有50-100%之間的序列同一性，優選至少50%的序 列同一'I"生，優選至少60 %的序列同一'丨生，優選至少70 %，更優選至少80 %，更優選至少90 % 且最優選至少95%序列同一性的序列。技術人員將會認識到，可通過考慮密碼子簡并性、氨 基酸相似性、閱讀框定位等等適當調整這些值以確定兩個核苷酸序列所編碼的蛋白質的相 應同一性。用于這些目的的氨基酸序列的實質同一性通常意指55-100%之間的序列同一 性，優選至少55 %，優選至少60 %，更優選至少70 %、80 %、90 %，最優選至少95 %。
[0163] 在肽的情形中，術語"基本上相同"指肽包含在指定比較窗口上與參考序列具有 55-100 %之間的序列同一性；優選與參考序列具有至少55%的序列同一性，優選60%，優 選70%，更優選80%，最優選至少90 %或95%的序列同一性。優選地，利用Needleman和 Wunsch(出處同上）的同源比對算法進行最佳比對。兩條肽序列是基本上相同的指示是，一 種肽可與針對第二種肽產生的抗體發生免疫反應。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別 僅在于保守置換的話，則這兩種肽基本上相同。此外，當某種肽與第二種肽差別在于非保守 變化時，如果抗體識別的表位基本上相同，則它們基本上相同。"基本上上相似的"肽共有如 上所述的序列，例外的是不相同的殘基位置差別可在于保守氨基酸變化。
[0164] 表 1
[0165]

【權利要求】
1. 一種用于通過下列方式增加植物中產量或維持植物中產量穩定性的方法：a)通過 在雄性生殖組織優選的啟動子的控制下表達轉基因來減少雄性生殖組織發育；以及b)在 雄性和雌性組織同時發育期間增加分配至雌性生殖組織的營養物質。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述雄性生殖組織為穗絲。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述雄性生殖組織發育通過表達可操作地連接到 啟動子的基因而減少，所述啟動子包括選自列表的序列的至少100個連續核苷酸。
4. 由根據權利要求1所述的方法得到的植物。
5. 根據權利要求4所述的植物的細胞。
6. 根據權利要求4所述的植物的種子或子代。
7. 包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸引發植物細胞中的轉錄并且包括選 自如下的序列： a) 選自 SEQ ID NO :64-106、134-137、142、144、149、150 的序列； b) 選自 SEQ ID NO :64-106、134-137、142、144、149、150 的序列的至少 100 個連續核苷 酸，以及 c) 與選自 SEQ ID NO :64-106、134-137、142、144、149、150 的序列的全長具有至少 70% 序列同一性的序列。
8. 表達盒，其包含可操作地連接到目的多核苷酸的根據權利要求7所述的多核苷酸。
9. 載體,其包含根據權利要求8所述的表達盒。
10. 植物細胞，所述植物細胞在其基因組中穩定摻入根據權利要求8所述的表達盒。
11. 根據權利要求10所述的植物細胞，其中所述植物細胞來自單子葉植物。
12. 根據權利要求11所述的植物細胞，其中所述單子葉植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕 麥、裸麥、高粱或水稻。
13. 植物，所述植物在其基因組中穩定摻入根據權利要求8所述的表達盒。
14. 根據權利要求13所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
15. 根據權利要求14所述的植物，其中所述單子葉植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕麥、裸 麥、高粱或水稻。
16. 根據權利要求13所述的植物的轉基因種子。
17. 根據權利要求13所述的植物，其中所述目的多核苷酸編碼賦予病原體或昆蟲抗性 的基因廣物。
18. 根據權利要求13所述的植物，其中所述表達盒編碼涉及營養物質吸收、氮利用效 率、耐旱性、根強度、根耐倒伏性、土壤害蟲管理、玉米根蟲抗性、碳水化合物代謝、蛋白質代 謝、脂肪酸代謝或植物激素生物合成的多肽。
【文檔編號】C12N15/82GK104203973SQ201380014293
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月12日 優先權日:2012年3月13日
【發明者】M.郭, K.R.海斯, M.A.魯普, B.沈, C.R.西蒙斯, Y.吳 申請人:先鋒國際良種公司