本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及新月藻活性蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

微藻作為優(yōu)良的天然餌料被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，是多種軟體動物、甲殼類幼體和浮游動物（如輪蟲）的主要食源。微藻的餌料價值與許多因素有關(guān)，包括細(xì)胞大小、細(xì)胞壁的可消化程度和細(xì)胞內(nèi)容物的生化組成，尤以后者最為重要。很早就有人注意到環(huán)境因子的改變對微藻生長及生化成分的影響，后續(xù)研究相繼闡述了各種微藻在不同的培養(yǎng)基配方、不同的培養(yǎng)方式以及不同的溫度、光強(qiáng)、通氣量、鹽度、qd、光周期和光質(zhì)下細(xì)胞內(nèi)生化成分的變化。新月藻(closlerium)屬于綠藻門，接合藻月、鼓燕科。已記錄的超過300種，生活在各種談水水體中。新月藻為單細(xì)胞體，細(xì)胞為新月形，中央有一核，核兩邊各有一個葉綠體。葉綠體的表面有縱的條狀突起，橫切面呈芒狀；葉綠體中有1列造粉核。細(xì)胞兩端各有一個液泡，其中有轉(zhuǎn)動的石膏結(jié)晶。與新月藻同類的還有鼓藻，但細(xì)胞形狀不一樣。鼓藻也是單細(xì)胞體，由2個“半細(xì)胞”和中間窄的藻腰組成。生殖方式與新月藻類相同。它們都屬于綠藻。大多數(shù)可作食用或飼料。綠藻向大自然釋放出大量的氧氣并含有大量的蛋白質(zhì)，綠藻對水體自凈和工業(yè)上都有相當(dāng)大的作用。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn102020705b的中國發(fā)明專利，公開了一種螺旋藻分離蛋白的制備方法，包括以下步驟：(1)螺旋藻細(xì)胞破碎脫色脫腥脫脂物料的制備；(2)稀鹽溶液提取蛋白與離心處理；(3)ph梯度分段調(diào)酸沉淀蛋白與調(diào)節(jié)中性；(4)超高溫瞬時滅菌和噴霧干燥。應(yīng)用該方法生產(chǎn)出的螺旋藻分離蛋白具有色澤淺、腥味淡、蛋白質(zhì)含量高、溶解性好和易消化的優(yōu)點(diǎn)，可作為一種優(yōu)質(zhì)全價蛋白質(zhì)營養(yǎng)補(bǔ)充劑或添加劑應(yīng)用，但是該制備方法采用超微粉碎處理進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎不徹底。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種活性蛋白純度高、得率高，工藝簡單有效，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大，適合大規(guī)模制備的新月藻活性蛋白的制備方法。

本發(fā)明針對上述技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：新月藻活性蛋白的制備方法，包括粗細(xì)胞破碎、鹽析、雙水相萃取、超濾，具體包括以下步驟：

細(xì)胞破碎：配置含水率為96-98%的藻液，加入功能蛋白肽，選用濃度為0.5-1%的pbs緩沖液作為提取溶劑，在均質(zhì)壓力為23-26mpa條件下均質(zhì)2-3次，保證每次從均質(zhì)機(jī)流出的蛋白混合液的溫度≤40℃，然后經(jīng)3-5℃、7000-9000rpm的低溫離心機(jī)離心18-22min，上清液即為蛋白粗提液，該步驟中pbs緩沖溶液對藍(lán)藻細(xì)胞壁的作用，削弱了細(xì)胞壁的強(qiáng)度，從而使細(xì)胞壁在勻漿下更容易破碎，另外，pbs緩沖液體系是弱酸性體系，接近生理環(huán)境，更利于藻蛋白活性的保持。高壓均質(zhì)機(jī)中的新月藻，通過可調(diào)高壓均質(zhì)閥，在驟然失壓狀態(tài)下，產(chǎn)生高速剪切沖擊現(xiàn)象，強(qiáng)烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成極細(xì)的均勻的乳化物態(tài)的分散物，高壓勻漿破碎新月藻細(xì)胞釋放藻蛋白，能夠批量化破碎藻細(xì)胞，利用工業(yè)化生產(chǎn)；

鹽析：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4至25-35%飽和度，3-5℃下靜止11-13h，然后在3-5℃、4000-6000rpm下離心20-25min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

雙水相萃取：將聚乙二醇和無機(jī)鹽配成ph為5.8-6.5，聚乙二醇濃度為15-17%，無機(jī)鹽濃度為11-13%的雙水相體系，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液，雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中；

超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為20-40kda超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為新月藻活性蛋白，該步驟可以在不破壞活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的濃度并且保證蛋白的純度不會減小甚至有所增加，該蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能夠清除活性氧，能通過驅(qū)除自由基從而表現(xiàn)出抗炎活性，蛋白的促紅細(xì)胞生成素活性較高，有刺激骨髓造血的功效，可用于動物的飼料或養(yǎng)魚餌料。

優(yōu)選的，細(xì)胞破碎步驟中功能蛋白肽的加入量為藻粉重量的0.008-0.01%，氨基酸序列為hshsvcvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，該蛋白肽上的正電荷與細(xì)菌質(zhì)膜磷脂分子上的負(fù)電荷通過靜電作用相互吸引而靠近，破壞脂質(zhì)雙分子層原有的有序結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上形成離子通道，改變新月藻細(xì)胞的滲透壓，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率。

優(yōu)選的，雙水相萃取步驟中無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽、磷酸鈉鹽、硫酸鈉、硫酸鉀、酒石酸鉀鈉中的一種或幾種混合。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1.本發(fā)明提供的新月藻活性蛋白的提取方法，提取出的活性蛋白純度高、得率高，工藝簡單有效，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大，適合大規(guī)模制備新月藻活性蛋白。

2.采用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，在驟然失壓狀態(tài)下，產(chǎn)生高速剪切沖擊現(xiàn)象，強(qiáng)烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成極細(xì)的均勻的乳化物態(tài)的分散物，高壓勻漿破碎新月藻細(xì)胞釋放藻蛋白，能夠批量化破碎藻細(xì)胞，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中。

4.該蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能夠清除活性氧，能通過驅(qū)除自由基從而表現(xiàn)出抗炎活性，蛋白的促紅細(xì)胞生成素活性較高，有刺激骨髓造血的功效，可用于動物的飼料或養(yǎng)魚餌料。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

新月藻活性蛋白的制備方法，包括粗細(xì)胞破碎、鹽析、雙水相萃取、超濾，具體包括以下步驟：

1）細(xì)胞破碎：配置含水率為98%的藻液，加入功能蛋白肽，選用濃度為0.7%的pbs緩沖液作為提取溶劑，在均質(zhì)壓力為25mpa條件下均質(zhì)3次，保證每次從均質(zhì)機(jī)流出的蛋白混合液的溫度≤40℃，然后經(jīng)4℃、8000rpm的低溫離心機(jī)離心20min，上清液即為蛋白粗提液，該步驟中pbs緩沖溶液對藍(lán)藻細(xì)胞壁的作用，削弱了細(xì)胞壁的強(qiáng)度，從而使細(xì)胞壁在勻漿下更容易破碎，另外，pbs緩沖液體系是弱酸性體系，接近生理環(huán)境，更利于藻蛋白活性的保持。高壓均質(zhì)機(jī)中的新月藻，通過可調(diào)高壓均質(zhì)閥，在驟然失壓狀態(tài)下，產(chǎn)生高速剪切沖擊現(xiàn)象，強(qiáng)烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成極細(xì)的均勻的乳化物態(tài)的分散物，高壓勻漿破碎新月藻細(xì)胞釋放藻蛋白，能夠批量化破碎藻細(xì)胞，利用工業(yè)化生產(chǎn)；

2）鹽析：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4至32%飽和度，4℃下靜止12h，然后在4℃、5000rpm下離心2min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

3）雙水相萃取：將聚乙二醇和無機(jī)鹽配成ph為6，聚乙二醇濃度為16%，無機(jī)鹽濃度為12%的雙水相體系，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液，雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中；

4）超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為30kda超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為新月藻活性蛋白，該步驟可以在不破壞活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的濃度并且保證蛋白的純度不會減小甚至有所增加，該蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能夠清除活性氧，能通過驅(qū)除自由基從而表現(xiàn)出抗炎活性，蛋白的促紅細(xì)胞生成素活性較高，有刺激骨髓造血的功效，可用于動物的飼料或養(yǎng)魚餌料。

上述細(xì)胞破碎步驟中功能蛋白肽的加入量為藻粉重量的0.01%，氨基酸序列為hshsvcvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，該蛋白肽上的正電荷與細(xì)菌質(zhì)膜磷脂分子上的負(fù)電荷通過靜電作用相互吸引而靠近，破壞脂質(zhì)雙分子層原有的有序結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上形成離子通道，改變新月藻細(xì)胞的滲透壓，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率。

上述雙水相萃取步驟中無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽、磷酸鈉鹽、硫酸鈉、硫酸鉀、酒石酸鉀鈉中的一種或幾種混合。

實(shí)施例2：

新月藻活性蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：

1）配置含水率為976-98%的藻液，加入重量為藻粉重量的0.01%的功能蛋白肽，選用濃度為0.8%的pbs緩沖液作為提取溶劑，在均質(zhì)壓力為26mpa條件下均質(zhì)2次，保證每次從均質(zhì)機(jī)流出的蛋白混合液的溫度≤40℃，然后經(jīng)5℃、9000rpm的低溫離心機(jī)離心18min，上清液即為蛋白粗提液，該步驟中pbs緩沖溶液對藍(lán)藻細(xì)胞壁的作用，削弱了細(xì)胞壁的強(qiáng)度，從而使細(xì)胞壁在勻漿下更容易破碎，另外，pbs緩沖液體系是弱酸性體系，接近生理環(huán)境，更利于藻蛋白活性的保持。高壓均質(zhì)機(jī)中的新月藻，通過可調(diào)高壓均質(zhì)閥，在驟然失壓狀態(tài)下，產(chǎn)生高速剪切沖擊現(xiàn)象，強(qiáng)烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成極細(xì)的均勻的乳化物態(tài)的分散物，高壓勻漿破碎新月藻細(xì)胞釋放藻蛋白，能夠批量化破碎藻細(xì)胞，利用工業(yè)化生產(chǎn)；

2）向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4至35%飽和度，5℃下靜止11h，然后離心，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

3）雙水相萃取：將聚乙二醇和磷酸鉀鹽配成ph為6.5，聚乙二醇濃度為15%，無磷酸鉀濃度為13%的雙水相體系，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液，雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中；

4）將蛋白溶液置于截留分子量為40kda超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為新月藻活性蛋白，該步驟可以在不破壞活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的濃度并且保證蛋白的純度不會減小甚至有所增加，該蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能夠清除活性氧，能通過驅(qū)除自由基從而表現(xiàn)出抗炎活性，蛋白的促紅細(xì)胞生成素活性較高，有刺激骨髓造血的功效，可用于動物的飼料或養(yǎng)魚餌料。

實(shí)施例3：

新月藻活性蛋白的制備方法，具體步驟為：配置含水率為96-98%的藻液，加入功能蛋白肽，選用濃度為1%的pbs緩沖液作為提取溶劑，在均質(zhì)壓力為24mpa條件下均質(zhì)3次，然后經(jīng)低溫離心機(jī)離心；向上清液中加入(nh4)2so4至30%飽和度，靜止，離心，即得鹽析沉淀物；將聚乙二醇和酒石酸鉀鈉配成ph為6.5、聚乙二醇濃度為17%、酒石酸鉀鈉濃度為11%的雙水相體系，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液；將蛋白溶液置于截留分子量為20-40kda超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為新月藻活性蛋白。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>舟山富晟食品科技有限公司

<120>新月藻活性蛋白的制備方法

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