一種檢測土壤中重金屬污染物潛在遺傳毒性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測土壤中重金屬潛在遺傳毒性的方法，它是經過1.土壤的消解；2.微藻細胞的制備；3.鋪膠；4.裂解；5.電泳；6.中和；7.染色；8.DNA損傷程度分析和統計用Origin7.5軟件進行ANOVA分析等步驟。彗星圖像分析采用CASP軟件，在評價參數中，尾動量（olive?tail?moment，OTM）同時反映了彗星中DNA含量和彗尾形狀特征，是定量化DNA損傷程度的常用指標。本發明方法是一種有效的測試方法，可以評級土壤中重金屬的遺傳毒性。
【專利說明】一種檢測土壤中重金屬污染物潛在遺傳毒性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境健康遺傳毒理學領域，具體涉及一種檢測土壤中重金屬潛在遺傳毒性的方法。
【背景技術】
[0002]土壤是人類生存與發展的重要自然資源和整個陸地生態系統賴以存在的基礎，又是重要的環境要素之一。“健康”的土壤對于農業可持續發展和人類的生存非常重要。但是，隨著我國經濟的高速發展，土壤污染的問題日益嚴重，嚴重的土壤污染特別是重金屬污染已經成為目前包含城市土壤在內的許多土壤的一個共同特性，據估計我國已經有10萬km2 土壤被污染，而且我國土壤污染重金屬中As、Cd、Cr、Hg和Pb等高毒性重金屬污染嚴重。有研究表明重金屬對生物具有較強誘變性。因此，對土壤中有害重金屬污染物進行調查并對其遺傳毒性的研究已迫在眉睫，甚至有人提出土壤中是否含有遺傳毒性物質，應是評價土壤的主要指標。所以建立一種有效的測試方法評價土壤中重金屬的遺傳毒性是環境監測的一項重要工作。
[0003]對各種環境因子遺傳毒性效應的生物檢測在毒理學研究中已占有十分重要的地位，它們在環境污染監測及環境保護中發揮了積極的作用。大量的遺傳學分析方法被用于識別生殖細胞誘變劑、體細胞誘變劑、潛在的致癌劑，以及與人類健康相關的各種各樣的遺傳改變，所涉及的方法已經超過200種。根據遺傳毒性效應檢測方法所涉及的終端指標范圍，可以把它們劃分為三大類。第一類檢測基因突 變；第二類檢測染色體畸變，包括染色體結構和/或數目的異常改變；第三類測定DNA損傷的標志如DNA損傷修復的激發、DNA加合物的形成、姐妹染色單體交換、體細胞重組及DNA鍵斷裂等?；蛲蛔兊臋z測主要有正向和反向兩類。正向突變改變野生型基因，使得有關基因失活而表現出可檢測的表型變異。相反，回復突變是通過突變使原突變子中失活的基因功能恢復，從而表現野生型表型。染色體畸變一般包括染色體結構和數目的改變，染色體結構改變包括染色體斷裂、倒位、異位和重復等。檢測染色體畸變通常采用細胞遺傳學技術。用于檢測染色體結構異常的體系一般是高等生物，尤其是哺乳動物體內及體外系統。近年來，由于分子生物學的發展和技術的進步，使遺傳毒理學領域里產生了許多新的基因毒性測試方法。盡管基因突變檢測額度“金標準”是直接DNA測序，而且自動DNA測序能力也有長足的進展，但測序仍然是一個比較繁瑣、費用高、需要昂貴設備的工作，不適合大范圍篩查基因組中DNA突變。
[0004]DNA是生物體內的遺傳物質，它的穩定對于生物體的正常繁殖和生長是至關重要的。然而環境中各種理化及生物因子一如電離輻射、各種氧化劑、細菌等都可能引起DNA損傷。單細胞凝膠電泳(singe cell gel electrophoresis assay,簡稱SCGE,又名彗星試驗,comet assay)是一個廣泛用于真核生物單細胞DNA單鏈、雙鏈、堿基不穩定點和修復延遲位點的量化檢測手段，該方法簡便、快捷、靈敏，每109Da可檢出0.1個斷裂等特點而得到了廣泛應用。與經典的染色體畸變、微核、SCE相比，SCGE可以用于活細胞DNA檢測，也能用于死亡細胞的DNA分析，使SCGE不僅可以研究低劑量下的生物效應，也可以用于研究高劑量下的生物效應；同時SCGE又可提供DNA修復能力的信息，這使得SCGE非常適合用于評價受試物的遺傳效應。
[0005]單細胞凝膠電泳技術是由Ostling于1984年首創,其后又由Singh和Olive分別加以改進，形成目前的堿性和中性裂解兩類方法。該技術盡管原理、方法簡單，其操作過程卻十分困難。在制作膠的過程中，一般要在磨毛載玻片上滴加凝膠2— 3層，每次用蓋玻片蓋壓，在揭取蓋玻片時，極易損壞膠板。在其后的裂解、電泳、洗滌過程中，凝膠長時間浸泡、沖洗，即使極輕的振蕩，也可能將膠板沖動漂起，膠板的損傷常至實驗失敗。
[0006]從理論上講SCGE技術適合于一切真核細胞,樣品細胞需要量小，細胞可以是培養的細胞系或細胞組織分離的細胞，目前已經用過的細胞有人體淋巴細胞、表皮細胞、血細胞、成纖維細胞、睪丸細胞、腫瘤細胞、動物肝臟細胞、植物的根細胞和葉片細胞及酵母細胞等。但是有關藻類的彗星實驗國內外都鮮有報道。藻類是生態環境的重要組成部分，將藻類用于SCGE，拓展SCGE的研究對象。

【發明內容】

[0007]本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測土壤中重金屬潛在遺傳毒性的方法，具體的說就是提供一種利用微藻DNA損傷檢測土壤中重金屬污染物的潛在遺傳毒性的方法。
[0008]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0009]一種檢測土壤中重金屬污染物潛在遺傳毒性的方法，包括如下步驟:
[0010]步驟1.土樣的前處理:采集土壤樣品，風干后，過直徑為2mm的土篩，去除植物殘體、石塊等后，用瑪瑙研缽研磨，全部通過80目篩。土壤經消解后，用Iml硝酸溫熱溶解殘渣，然后將溶液轉移至50ml容量瓶中，定容，搖勻，保存備用；
[0011]步驟2.細胞制備:將微藻細胞接種到步驟(1)得到的土壤金屬提取液中進行染毒，將去離子水染毒的微藻細胞作為對照；將上述染過毒的微藻細胞分別經離心去除液體部分，用PBS重新懸浮細胞，得到細胞懸液，離心純化備用；
[0012]步驟3.鋪膠:
[0013]步驟3a.以l%g/mL的正常熔點瓊脂糖(NMA) PBS溶液(l%g/mL即IOOmLPBS中加Alg NMA，以下定義相同)300--500 μ L在磨砂載玻片上打底，再刮去，這樣可以使第一層膠更容易固定住載玻片上；
[0014]步驟3b.制備第一層膠:將60—120 μ L0.7%g/mL的正常熔點瓊脂糖(NMA) PBS溶液滴在步驟3a得到的磨砂載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，4°C固化5-10min ；
[0015]步驟3c.制備第二層膠:向步驟2處理得到的細胞中加入0.7%g/mL的低熔點瓊脂糖(LMA)PBS溶液，重懸藻泥，吹打均勻成細胞懸液，調整細胞濃度I X IO5--1 X IO6個細胞/mL。然后取出第一層膠已凝的玻片，輕拔移除蓋，取50-120 μ L加到第一層膠上，蓋上蓋玻片，4°C 固化 30-40min ；
[0016]步驟3d.制備第三層膠:第二層凝固后，取50—120 μ Ll%g/mL的正常熔點瓊脂糖(NMA)的PBS溶液鋪第三層膠，蓋上蓋玻片后，放入冰箱使其凝固；
[0017]步驟4.裂解:將步驟3d制備好的載玻片去掉蓋玻片，浸入4°C堿性裂解液(2.5mol/LNa0H, 1.0mmol/L Na2-EDTA,0.01%SDS (w/v)，pH=10，用前加入 l%TritonX_100 和10%DMS0)，裂解 10min-2h ；[0018]步驟5.電泳:取出裂解后的載玻片，放入電泳槽，向槽中緩慢注入堿性電泳液(pH=13.0),靜置20min后開始電泳，電流200—300mA,電壓18—25V，電泳時間20min ；
[0019]步驟6.中和:用pH7.5,0.4mmol/L Tris-HCl緩沖液浸沒載玻片，漂洗每次5min，中和3次；
[0020]步驟7.染色:膠上滴加50μ g/mL的溴化乙錠(EB) 30 μ L，加蓋蓋玻片，24h內鏡檢；
[0021]步驟8.DNA損傷程度分析:用熒光顯微鏡在綠光激發下觀察，拍照，獲取彗星圖像后，用CASP軟件分析測量DNA遷移的參數:尾矩(TM)和尾動量(0ΤΜ)，用其評價土壤中重金屬潛在的遺傳毒性。
[0022]步驟9.實驗至少設3個平行，取其平均值；統計用0rigin7.5軟件進行ANOVA分析，將實驗組和對照組進行顯著性t檢驗，以p〈0.05作為顯著性依據。
[0023]彗星圖像分析采用CASP軟件,在評價參數中，尾動量(olive tail moment, OTM)同時反映了彗星中DNA含量和彗尾形狀特征，是定量化DNA損傷程度的常用指標。另外，提供尾矩(TM)參數作為參考指標，以便較全面反映DNA損傷情況。每張載玻片至少分析50個細胞。
[0024]上述的方法，步驟I中，所述的消解操作過程如下:
[0025]稱取0.2000g過80目的風干土樣于30ml聚四氟乙烯坩堝中，加5ml HCl低溫加熱，使樣品初步分解，待蒸發至2-3ml時，取下稍冷，然后加入5ml硝酸(工藝超純)，3ml氫氟酸、3ml高氯酸，加蓋后于電熱板上中溫加熱I小時左右(注意溫度不要太高，以免溶液冒出)，然后開蓋，繼續加熱除硅，并經常搖動坩堝以達到良好的飛硅效果，當加熱至冒濃厚高氯酸白煙時，加蓋，使黑色有機碳化物充分分解，待坩堝上的黑色有機物消失后，開蓋驅趕白煙并蒸至內容物呈粘稠狀，視消解情況可再加入2ml硝酸、2ml氫氟酸、2ml高氯酸重復上述過程，當白煙再次基本冒盡且內容物呈粘稠狀時，取下稍冷，用水沖洗坩堝蓋和內壁。
[0026]上述的方法，步驟2和步驟3中，所述的微藻細胞為纖細裸藻細胞。
[0027]上述的方法，步驟3a優選的是以l%g/mL的正常熔點瓊脂糖350 μ L在磨砂載玻片上打底。
[0028]上述的方法，步驟3b優選的是將100 μ L0.7%g/mL的正常熔點瓊脂糖滴在步驟3a預制得到的載玻片上。
[0029]上述的方法，步驟3c中，優選的是取75 μ L細胞懸液滴加到第一層膠上。
[0030]上述的方法，步驟3d中，優選的是在第二層膠上滴加100 μ Ll%g/mL的正常熔點瓊脂糖。
[0031]上述的方法，步驟4中，優選的是裂解時間為20min。
[0032]上述的方法，步驟5中，優選的是電泳電流為200mA，電壓為20V，電泳時間為20mino
[0033]有益效果:本發明與現有技術相比具有如下優點:
[0034](I) 土壤及水系中沉積物重金屬污染，會影響與之相關的生態系統，伴隨著吸收、吸附、浸出等物理化學生物過程，重金屬會遷移至植被和水體環境中，從而進入食物鏈，造成人類和動物受到危害，嚴重的甚至會影響周邊的生態和環境經濟發展?？焖佟蚀_的測定復雜環境介質(土壤和沉積物)需要涉及到樣品前處理和儀器分析方法。樣品前處理是將土壤進行消解，使金屬溶解在水中，儀器分析現在常用的手段是電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)。然而儀器分析費用昂貴且只能確定土壤樣品中重金屬的含量。本發明將土壤消解的溶液用于對藻的遺傳毒性試驗，可以快速的判斷土壤中是否存在遺傳毒性物質。
[0035](2)先消解土樣，得到的溶液用于給纖細裸藻染毒，應用纖細裸藻的彗星實驗，對土壤中重金屬的遺傳毒性進行研究，建立一種有效的測試方法，評級土壤中重金屬的遺傳毒性。土壤是人類生存與發展的重要自然資源和整個陸地生態系統賴以存在的基礎，又是重要的環境要素之一?！敖】怠钡耐寥缹τ谵r業可持續發展和人類的生存非常重要。但是，隨著我國經濟的高速發展，土壤污染的問題日益嚴重，嚴重的土壤污染特別是重金屬污染已經成為目前包含城市土壤在內的許多土壤的一個共同特性，據估計我國已經有10萬km2土壤被污染，而且我國土壤污染重金屬中As、Cd、Cr、Hg和Pb等高毒性重金屬污染嚴重。因此，開展土壤中重金屬對遺傳毒性評價，這是對土壤管理、保障人民健康、保護人口資源以及社會經濟與環境的協調發展都具有重大意義的。
[0036](3)采用了特殊的制膠方法，即第一層刮膠，然后采用傳統的“三明治”制膠的方法，在第三層改用熔點較高的正常熔點較NMA制膠，NMA的熔點高不容易脫膠，能夠很好保護好膠體，因此基本解決了傳統方法膠板易受損的缺點。
[0037](4)藻類是生態環境的重要組成部分，將藻類用于SCGE，拓展SCGE的研究對象。從理論上講SCGE技術適合于一切真核細胞,樣品細胞需要量小,細胞可以是培養的細胞系或體細胞組織分離的細胞，目前已經用過的細胞有人體淋巴細胞、表皮細胞、血細胞、成纖維細胞、睪丸細胞、腫瘤細胞、動物肝臟細胞植物的跟細胞和葉片及酵母細胞等。但是有關藻類的彗星實驗國內\外都鮮有報道。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為本發明步驟3舖膠制片的示意圖。其中，I為1%NMA，2為0.7%LMA&藻，3為1%的NMA，4為磨砂載玻片。
[0039]圖2為去離子水對纖細裸藻DNA無損傷的彗星圖像(未受損傷的細胞核一沒有彗尾)。
[0040]圖3為土壤金屬提取液對纖細裸藻DNA損傷的彗星圖像(受損傷的細胞核一有很長的彗尾)。
[0041]圖4a和圖4b為不同土壤提取液對纖細裸藻DNA損傷的影響，其中a為不同土壤提取液對纖細裸藻DNA損傷的尾動量影響，b為不同土壤提取液對纖細裸藻DNA損傷的尾矩影響，*與空白對照相比P〈0.05。
【具體實施方式】:
[0042]根據下述實施例，可以更好的理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0043]實施例1:
[0044]I 土樣的前處理:[0045]在紫金山采集土樣作為清潔土壤對照，在某鋼鐵廠的兩個地方采樣編號為某鋼I號和某鋼2號。采樣按國家環境保護局規范方法采集土樣，土樣的基本理化性質與重金屬含量見表1。
[0046]表1 土壤樣品基本理化性質與重金屬含量
[0047]
【權利要求】
1.一種檢測土壤中重金屬污染物潛在遺傳毒性的方法，其特征是:它包括如下步驟: 步驟1.土樣的前處理:采集土壤樣品，風干后，過直徑為2_的土篩，去除植物殘體、石塊等后，用瑪瑙研缽研磨，全部通過80目篩。土壤經消解后，用Iml硝酸溫熱溶解殘渣，然后將溶液轉移至50ml容量瓶中，定容，搖勻，保存備用； 步驟2.細胞制備:將微藻細胞接種到步驟(1)得到的土壤金屬提取液中進行染毒，將去離子水染毒的微藻細胞作為對照；將上述染過毒的微藻細胞分別經離心去除液體部分，用PBS重新懸浮細胞，得到細胞懸液，離心純化備用； 步驟3.鋪膠: 步驟3a.以l%g/mL的正常熔點瓊脂糖(NMA) PBS溶液(l%g/mL即IOOmLPBS中加入IgNMA，以下定義相同)300-500 μ L在磨砂載玻片上打底，再刮去，這樣可以使第一層膠更容易固定住載玻片上； 步驟3b.制備第一層膠:將60—120 μ L0.7%g/mL的正常熔點瓊脂糖(NMA) PBS溶液滴在步驟3a得到的磨砂載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，4°C固化5-10min ； 步驟3c.制備第二層膠:向步驟2處理得到的細胞中加入0.7%g/mL的低熔點瓊脂糖(LMA)PBS溶液，重懸藻泥，吹打均勻成細胞懸液，調整細胞濃度I X IO5--1 X IO6個細胞/mL。然后取出第一層膠已凝的玻片，輕拔移除蓋，取50-120 μ L加到第一層膠上，蓋上蓋玻片，4°C 固化 30-40min ； 步驟3d.制備第三層膠:第二層凝固后，取50—120 μ Ll%g/mL的正常熔點瓊脂糖(NMA)的PBS溶液鋪第三層膠，蓋上蓋玻片后，放入冰箱使其凝固； 步驟4.裂解:將步驟3d制備好的載玻片去掉蓋玻片，浸入4°C堿性裂解液(2.5mol/LNaOH, 1.0mmoI/L Na2-EDTA, 0.01%SDS(w/v)，pH=10，用前加入 l%TritonX_100 和 10%DMS0)，裂解 10min-2h ； 步驟5.電泳:取出裂解后的載玻片，放入電泳槽，向槽中緩慢注入堿性電泳液(pH=13.0),靜置20min后開始電泳，電流200—300mA,電壓18—25V，電泳時間20min ；步驟6.中和:用pH7.5,0.4mmol/L Tris-HCl緩沖液浸沒載玻片，漂洗每次5min，中和3次； 步驟7.染色:膠上滴加50μ g/mL的溴化乙錠(EB) 30 μ L，加蓋蓋玻片，24h內鏡檢；步驟8.DNA損傷程度分析:用熒光顯微鏡在綠光激發下觀察，拍照，獲取彗星圖像后，用CASP軟件分析測量DNA遷移的參數:尾矩(TM)和尾動量(0ΤΜ)，用其評價土壤中重金屬潛在的遺傳毒性。 步驟9.實驗至少設3個平行，取其平均值；統計用0rigin7.5軟件進行ANOVA分析，將實驗組和對照組進行顯著性t檢驗，以p〈0.05作為顯著性依據。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是:步驟I中，所述的消解操作過程如下: 稱取0.2000g過80目的風干土樣于30ml聚四氟乙烯坩堝中，加5ml HCl低溫加熱，使樣品初步分解，待蒸發至2-3ml時，取下稍冷，然后加入5ml硝酸(工藝超純)，3ml氫氟酸、3ml高氯酸，加蓋后于電熱板上中溫加熱I小時左右(注意溫度不要太高，以免溶液冒出)，然后開蓋，繼續加熱除硅，并經常搖動坩堝以達到良好的飛硅效果， 當加熱至冒濃厚高氯酸白煙時，加蓋，使黑色有機碳化物充分分解，待坩堝上的黑色有機物消失后，開蓋驅趕白煙并蒸至內容物呈粘稠狀，視消解情況可再加入2ml硝酸、2ml氫氟酸、2ml高氯酸重復上述過程，當白煙再次基本冒盡且內容物呈粘稠狀時，取下稍冷，用水沖洗坩堝蓋和內壁。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是:步驟2和步驟3中，所述的微藻細胞為纖細裸藻細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是:步驟3&以1°/呢/!^的正常熔點瓊脂糖35(^1^在磨砂載玻片上打底。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是:步驟3b是將100μ L0.7%g/mL的正常熔點瓊脂糖滴在步驟3a預制得到的載玻片上。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征是:步驟3c中是取75μ L細胞懸液滴加到第一層月父上。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是:步驟3d中是在第二層膠上滴加100μ Ll%g/mL的正常熔點瓊脂糖。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征是:步驟4中，裂解時間為20min。
9.根據權利要求1所述的方法， 其特征是:步驟5中，電泳電流為200mA，電壓為20V，電泳時間為20min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740826SQ201410010581
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月8日 優先權日:2014年1月8日
【發明者】李梅, 崔益斌, 張劉俊, 嵇伏年, 李雅潔 申請人:南京大學