多異瓢蟲特異性coi引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及多異瓢蟲特異性COI引物以及含有該引物的檢測試劑盒，根據多異瓢蟲特有的mtDNA序列，設計了一對多異瓢蟲特異性COI引物HvF1和HvR1（SEQ?ID?No.1和2），該對引物僅對多異瓢蟲具有特異性擴增能力，擴增產物大小為230bp，質粒濃度檢出限為1.503567837E+05，DNA濃度檢出限為1.5ng/μL。本發明采用PCR技術，提高了檢測準確性，節約了檢測時間，所述試劑盒產品適于基層推廣應用。
【專利說明】多異瓢蟲特異性CO I引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及多異瓢蟲特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]多異瓢蟲Hippodamia variegate (Goeze)屬昆蟲綱、鞘翅目、瓢蟲科瓢蟲亞科。常捕食棉蚜、麥蚜、豆蚜、玉米蚜等蚜蟲，所以多見于棉花、小麥、豇豆、玉米等農作物中。多異瓢蟲起源于古北區，在歐洲是常見的蚜蟲捕食者，同時在南非、肯尼亞、印度、中國、加拿大、美國、智利都有記載。在我國新疆、山東等地，多異瓢蟲是棉蚜的重要捕食性天敵；在南非，它對麥雙尾蚜的害蟲控制作用也非常顯著。由此可見，多異瓢蟲是一種有效地生物防治物種。
[0003]同時，多異瓢蟲也捕食同一生境的其他自然天敵，該捕食現象稱為集團內捕食作用。隨著對該作用研究的深入，研究人員發現其對農田生態系統中不同物種的種群動態以及對害蟲生物防治效果產生復雜而巨大的影響。在研究方法學方面，發現常規的腸道解剖、行為觀察等傳統研究方法無法準確評估瓢蟲集團內瓢蟲之間的捕食作用。目前，對多異瓢蟲進行特異性檢測的方法尚未建立，在物種鑒定領域，聚合酶鏈式反應(polymerase chainreaction, PCR)技術因其具有特異性強、靈敏度高、簡便快速等優點而占據重要地位。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供多異瓢蟲特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
[0005]為了實現本發明目的，本發明根據多異瓢蟲的線粒體DNA序列，設計一對多異瓢蟲特異性COI引物，其包括:
[0006]正向引物HvFl:5’ -GGAAGATTAATTGGAAATGAT-3’
[0007]反向引物HvRl:5 ’ -CCTATTTCAACAATTCTTCTAAAT-3 ’。
[0008]本發明還提供含有引物HvFl和HvRl的用于檢測多異瓢蟲的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液等中的至少一種。優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0009]本發明還提供所述引物HvFl和HvRl，以及含有引物HvFl和HvRl的試劑盒在檢測多異瓢蟲中的應用。
[0010]本發明還提供一種多異瓢蟲的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0011]I)提取樣品DNA;
[0012]2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物HvFl和HvRl進行PCR擴增反應；
[0013]3)分析PCR產物。[0014]PCR反應體系以20 μ L計為:
[0015]
【權利要求】
1.多異瓢蟲特異性COI引物，其特征在于，其包括: 正向引物 HvFl:5’ -GGAAGATTAATTGGAAATGAT-3’ 反向引物 HvRl:5’ -CCTATTTCAACAATTCTTCTAAAT-3’。
2.含有權利要求1所述引物的用于檢測多異瓢蟲的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的至少一種。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.權利要求1所述引物或權利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測多異瓢蟲中的應用。
6.多異瓢蟲的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品DNA； 2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物HvFl和HvRl進行PCR擴增反應； 3)分析PCR產物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應體系以20μ L計為:
模板 DNA1.0llL
2.5mM dNTPs0.4li L
1(^1^引物}^「丨0.4μ?
ΙΟμΜ 引物 HvRl0.4liL
5U&L Easy Taq DNA聚合酶0_2μ?
10 X Easy 緩沖液2.0μ.?CidH2O補足至 20μΕ。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為:94°C4分鐘；94°C30秒，56 0C 30秒，72 0C 30秒 ，共40個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757015SQ201410015249
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】楊帆, 王倩, 陸宴輝, 徐建祥 申請人:中國農業科學院植物保護研究所