用于檢測h7n9亞型流感病毒的引物組合及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于檢測H7N9亞型流感病毒的引物組合及含有所述引物組合的檢測試劑盒。所述引物組合包括特異性擴增H7N9亞型流感病毒HA基因的引物對（Seq?ID?No.1和2）以及特異性擴增H7N9亞型流感病毒NA基因的引物對（Seq?ID?No.3和4）。兩對PCR引物可在同一PCR反應管里同時進行擴增，實現雙重檢測，經優化后可在5小時內完成H7N9亞型流感病毒HA和NA基因的快速分子鑒定，具有快速簡便、特異性及靈敏度高、低成本、結果穩定等優點，對H7N9禽流感疫情的早期預警、疫區的病原監測等方面具有重要意義。
【專利說明】用于檢測H7N9亞型流感病毒的引物組合及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及H7N9亞型流感病毒的檢測，具體地說，涉及一種用于檢測H7N9亞型流感病毒的引物組合及含有所述引物組合的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]甲流病毒可引起鳥類和一些哺乳類動物的流感，屬于正黏液病毒科。在鳥類中已經分離得到所有甲流病毒亞型病毒株，其中一些亞型可以在家禽及人類中引發嚴重的流感。
[0003]甲型流感病毒是負義單鏈RNA病毒,根據病毒薄膜表面血凝素(hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(neuraminidase,NA),可分為不同的亞型。目前已發現17種不同的血凝素(Hl到H17)和9種不同的神經氨酸酶(NI到N9)，所以理論上存在153種不同的組合。最新的H17抗原類型是2012年在果蝠中分離得到的。H7N9亞型禽流感病毒是其中的一種，以往僅在禽間發現，未發現過人的感染情況。
[0004]在H7N9病毒之前，已經有11種甲型流感病毒感染人類，它們分別是H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H5N2 和 H10N7。
[0005]2013年中國出現了人感染H7N9亞型禽流感病例。H7N9型禽流感是一種新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽兩地率先發現。H7N9型禽流感是全球首次發現的新亞型流感病毒，尚未納入我國法定報告傳染病監測報告系統，且截至2013年4月初尚未有疫苗推出。被該病毒感染均在早期出現發熱等癥狀，目前為止尚未證實此類病毒是否具有人傳染人的特性。經調查，H7N9禽流感病毒基因來自于東亞地區野鳥和中國上海、浙江、江蘇雞群的基因重配。截至2013年4月23日，全國共報告105例確診病例，其中死亡21人，康復13人，其余71人正在各定點醫療單位接受救治。
[0006]對H7N9亞型流感病毒片段的重配研究結果顯示，H7N9禽流感病毒的8個基因片段中，H7片段與浙江鴨群中分離的禽流感病毒相似，浙江鴨群中的病毒往上追溯，與東亞地區野鳥中分離的禽流感病毒基因相似；N9片段與東亞地區野鳥中分離的禽流感病毒相似。其余6個基因片段與H9N2禽流感病毒相似。據病毒基因組比對和親緣分析顯示，H9N2禽流感病毒來源于中國上海、浙江、江蘇等地的雞群。基因重配的發生地很有可能在中國的長三角地區，過程可能是亞歐大陸遷徙的野鳥(攜帶病毒)在自然遷徙過程中(經由韓國等東亞地區)和中國長三角地區的鴨群、雞群攜帶的禽流感病毒進行基因重配而產生。鴨群、雞群可能大量攜帶的禽流感病毒而不發病。
[0007]因此，開發一種快速簡便、特異性及靈敏度高、低成本、結果穩定的H7N9亞型禽流感鑒定方法成為亟待解決 的問題。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種用于檢測H7N9亞型流感病毒的引物組合及檢測試劑盒。[0009]為了實現本發明目的，本發明的一種用于檢測H7N9亞型流感病毒的引物組合，所述引物組合包括特異性擴增H7N9亞型流感病毒HA基因的引物對I以及特異性擴增H7N9亞型流感病毒NA基因的引物對11。
[0010]引物對1:
[0011]H7F:5，-GGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA-3，(Seq ID N0.1)
[0012]H7R:5，-GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3，(Seq ID N0.2)
[0013]引物對I1:
[0014]N9F:5，-TCTGAATGTGTATGCCACAAC-3，(Seq ID N0.3)
[0015]N9R:5，-TGAGCCCTGCCAATTGTCCC-3，(Seq ID N0.4)
[0016]本發明還提供含有上述引物組合的用于檢測H7N9亞型流感病毒的試劑盒。優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。更優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0017]本發明還提供利用上述引物組合或檢測試劑盒鑒定H7N9亞型流感病毒HA和NA基因的方法，該方法為:以待測樣品核酸(如cDNA、DNA)為模板，采用上述引物組合對H7N9亞型流感病毒HA和NA基因進行PCR擴增(可在同一 PCR反應管內進行，實現雙重檢測)，然后采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，當擴增產物出現132bp的特異性擴增條帶(Seq ID N0.5)時判斷為H7亞型HA基因，當擴增產物出現213bp的特異性擴增條帶(SeqID N0.6)時判斷為N9亞型NA基因。
[0018]PCR擴增體系為:模·板 4 μ L，2 X PCR擴增緩沖液 12.5 μ L，10 μ M Seq ID N0.1-4 引物各 luL，加 ddH20 至 25 μ L。
[0019]PCR擴增程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，61°C復性30s，72°C延伸30s，共35個循環；72°C延伸IOmin。
[0020]本發明設計了兩對PCR引物分別特異性擴增H7N9亞型流感病毒HA和NA基因，兩對PCR弓丨物可在同一 PCR反應管里同時進行擴增，實現雙重檢測，經優化后可在5小時內完成H7N9亞型流感病毒HA和NA基因的快速分子鑒定，具有快速簡便、特異性及靈敏度高、低成本、結果穩定等優點，對H7N9禽流感疫情的早期預警、疫區的病原監測等方面具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發明實施例2中利用引物組合檢測H7N9亞型流感病毒的特異性分析結果；其中，泳道I為H7N9亞型流感病毒樣品，泳道2為HlNl亞型流感病毒樣品，泳道3為H3N2亞型流感病毒樣品，泳道4為H9N2亞型流感病毒樣品，泳道5為純化水樣品對照，泳道6為不加模板的空白對照，泳道7為DNA Marker。
[0022]圖2為本發明實施例3中利用引物組合檢測H7N9亞型流感病毒的靈敏度分析結果；其中，泳道1-6為分別為樣品A-F的PCR擴增產物，泳道7為DNA Marker,泳道8和9分別為樣品G、H的PCR擴增產物，泳道10為陰性對照。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。[0024]以下實施例均按照常規實驗條件，如SambiOOk等分子克隆實驗手冊(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技術規程,或按照制造廠商所建議的實驗條件。
[0025]實施例1用于檢測H7N9亞型流感病毒的引物的合成
[0026]根據MEGA比對H7N9亞型流感病毒(來源于中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所)HA和NA基因序列的結果，用Primer Premier軟件設計用于特異性擴增H7N9亞型流感病毒HA和NA基因的引物，并將設計的引物與Genbank中所有的禽流感病毒及病毒數據進行比對，利用Primer Premier進行引物設計時綜合條件最優，進行BLAST時無其他序列配對情況。H7N9亞型流感病毒HA和NA的基因序列分別如Seq ID N0.8和9所示。
[0027]特異性擴增H7N9亞型流感病毒HA基因的PCR引物H7F和H7R，其堿基序列為:
[0028]H7F:5，-GGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA-3，(Seq ID N0.1)
[0029]H7R:5，-GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3J (Seq ID N0.2)
[0030]特異性擴增H7N9亞型流感病毒NA基因的PCR引物N9F和N9R，其堿基序列為:
[0031]N9F:5，-TCTGAATGTGTATGCCACAAC-3，(Seq ID N0.3)
[0032]N9R:5，-TGAGCCCTGCCAATTGTCCC-3J (Seq ID N0.4)
[0033]引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0034]實施例2利用引物組合檢測H7N9亞型流感病毒的特異性分析
[0035]1.樣本來源
[0036]本實施例中采用的H7N9亞型流感病毒毒株、HlNl亞型流感病毒毒株、H3N2亞型流感病毒毒株、H9N2亞型流感病毒毒株保存于中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所。
[0037]2.RNA的提取及cDNA的獲得
[0038]在P3實驗室內分別提取上述不同甲型流感病毒亞型毒株的RNA并反轉錄成cDNA。RNA 提取按 Simply P Total RNA Extraction Kit (BioFlux 公司、Cat#BSC52Ml)試劑盒說明書操作。采用M-MLV反轉錄酶(TaKaRa公司)建立如下反轉錄體系:提取的RNA30 μ L，反轉錄引物2 μ L。在75°C下反應5min，然后冰浴8min，置于冰上加入5 XMLV緩沖液12 μ L，dNTP (IOmM) 3 μ L, M-MLV 反轉錄酶 2.0 μ L，RNase 抑制劑 2.0 μ L，無 RNA 酶的 ddH209 μ L,42°C孵育90min，然后75°C 15min，進行反轉錄(反轉錄引物為5 ‘-AGCAAAAGCAGG-3’)。
[0039]3.PCR 反應
[0040]采用實施例1中合成的引物組合(Seq ID N0.1-4)分別對上述獲得的模板cDNA中的HA和NA基因進行PCR擴增，PCR擴增的反應體系(25 μ L體系)為:模板4 μ L，2 X TaqPCR MasterMix (TIANGEN公司、目錄號:ΚΤ201) 12.5 μ L, 10 μ M Seq ID N0.1-4 引物各 I μ L，加水至25 μ L0 PCR反應程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，61°C復性30s，72°C延伸30s，共35個循環；72°C延伸IOmin0
[0041 ] 4.PCR產物電泳檢測
[0042]取5 μ L上述PCR擴增產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行鑒定，電泳結果見圖1，圖中從左至右，泳道I 為Η7Ν9亞型流感病毒樣品，泳道2為HlNl亞型流感病毒樣品，泳道3為Η3Ν2亞型流感病毒樣品，泳道4為Η9Ν2亞型流感病毒樣品，泳道5為純化水樣品對照，泳道6為不加模板的空白對照，泳道7為DNA Marker0結果顯示第I泳道顯示的兩條特異性擴增條帶分別為132bp (Seq ID N0.5)和213b (Seq ID N0.6)，鑒定為H7N9亞型流感病毒；第2-6泳道分別為HlNl亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒、H9N2亞型流感病毒、水及空白對照，沒有出顯條帶；鑒定結果表明本發明的引物組合可特異地檢測出H7N9亞型流感病毒。
[0043]實施例3利用引物組合檢測H7N9亞型流感病毒的靈敏度分析
[0044]1.樣品濃度
[0045]在P3實驗室內對樣品A (107EID50/0.1mL H7N9亞型流感病毒)進行10倍梯度分別稀釋，稀釋成B (106EID50/0.1mL H7N9亞型流感病毒)、C (105EID50/0.ImL H7N9亞型流感病毒)、D (IO4EID50A).1mL H7N9亞型流感病毒)、E (103EID50/0.1mL H7N9亞型流感病毒)、F (IO2EID5tlAXlmL H7N9 亞型流感病毒)、G (10EID50/0.1mL H7N9 亞型流感病毒)、H(lEID50/0.1mL H7N9亞型流感病毒)、I (空白對照)，并提取樣品A-H的RNA，反轉錄成cDNA作為模板備用。
[0046]2.引物組合靈敏度檢測
[0047]采用實施例1中合成的引物組合(Seq ID N0.1-4)分別對樣品A-1的cDNA中的HA和NA基因進行PCR擴增。PCR擴增體系及擴增程序同實施例2。
[0048]3.結果
[0049]對上述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳檢測結果如圖2所示，圖中從左至右，泳道1-6為分別為樣品A-F的PCR擴增產物，泳道7為DNA Marker,泳道8和9分別為樣品G、H的PCR擴增產物，泳道10為陰性對照。結果顯示第1-6泳道出現兩條特異性擴增條帶分別為132bp (Seq ID N0.5)和213b (Seq ID N0.6)。利用本發明提供的引物組合可最低檢測出102EID5Q/0.1mL H7N9亞型流感病毒。
[0050]雖然，上文中已經用一般性說明及具`體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.用于檢測H7N9亞型流感病毒的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括特異性擴增H7N9亞型流感病毒HA基因的引物對I以及特異性擴增H7N9亞型流感病毒NA基因的引物對II ； 引物對1:
H7F:5’ -GGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA-3，
H7R:5’ -GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3’ ； 引物對II:
N9F:5’ -TCTGAATGTGTATGCCACAAC-3’
N9R:5’ -TGAGCCCTGCCAATTGTCCC-3’。
2.含有權利要求1所述引物組合的用于檢測H7N9亞型流感病毒的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
4.根據權利要求2或`3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
【文檔編號】C12Q1/70GK103866047SQ201410052165
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月14日 優先權日:2013年4月27日
【發明者】金寧一, 田明堯, 魯會軍, 李昌, 李霄, 周博, 胡寧寧, 薛斐, 辛舒 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所