本發明屬于生物技術領域，涉及一種甲型流感病毒重組蛋白、編碼該重組蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的質粒載體、轉化含有上述質粒載體的菌株，還涉及使用上述的重組蛋白制備甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，并應用于甲型流感病毒早期診斷。

背景技術：

流行性感冒(流感)多數是由甲型流感病毒引起的急性呼吸道感染，其傳染性強、傳播速度快，嚴重危害人類生命健康。這些年來，該疾病發病率逐年上升，但治療效果卻不甚理想，其中一個關鍵原因是無法實現甲型流感病毒早期快速診斷以爭取治療時間，從而導致患者病情惡化甚至死亡。因此，能夠在流感早期做出正確診斷顯得尤為重要。

目前，國內外對于甲型流感病毒診斷有如下幾種方法：

1.病毒分離培養

從呼吸道標本(咽拭子、鼻拭子、痰)中分離并培養流感病毒，準確率高、假陽性低。但這種檢測方法需要專業設備，對操作人員要求高，檢測時間長，不適合大量樣本快速診斷。

2.病毒核酸檢測

RT-PCR法檢測甲型流感病毒核酸，該方法特異性和敏感性好，能快速區分病毒亞型，適合大量樣本同時檢測，但是設備昂貴，對操作人員要求高，檢測時間較長，并且檢測費用高。

3.免疫學診斷

通過免疫學方法，具體采用單克隆抗體識別檢測呼吸道標本中的甲型流感病毒抗原，該方法特異性及靈敏度俱佳。若結合膠體金平臺，一般能在10～15分鐘內獲得準確結果，適合大批量樣本快速檢測，無特殊設備及人員要求。

目前，免疫學方法檢測甲型流感病毒由于操作簡便、結果易于判定，已成為主流方向。該方法通常需要制備可識別不同亞型甲型流感病毒單克隆抗體，工作量極大，因此，相對保守的甲型流感病毒核蛋白成為單克隆抗體制備及識別靶標。但常規甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體制備所使用的免疫原是基因工程技術表達的完整蛋白，由于堿基密碼子的緣故，該蛋白在大腸桿菌中表達困難、表達量極低，導致后續純化工作難以開展，嚴重阻礙其單克隆抗體制備。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源性緣故，使用流感病毒全長序列作為免疫原制備得到的單克隆抗體特異性差，與其它物種蛋白具有高度同源性，從而導致檢測結果失真。

技術實現要素：

設計目的：解決免疫學方法檢測甲型流感病毒的不足之處，通過設計、表達甲型流感病毒重組蛋白并制備其單克隆抗體，從而實現甲型流感病毒特異性檢測識別，既增強了檢測靈敏度兼顧其廣譜性，又不會導致檢測結果失真。

設計方案：為了實現上述設計目的。本申請：(1)以甲型流感病毒核蛋白為靶抗原，分析并選擇該抗原兩個優勢抗原表位，序列比較結果顯示所選擇的兩個抗原表位是所有亞型的甲型流感病毒核蛋白共有表位并與其它蛋白序列無明顯同源性。(2)為增強免疫效果并縮短單克隆抗體制備時間，將所選擇的兩個優勢抗原表位序列分別重復后通過柔性片段(連續四個甘氨酸)連接，形成甲型流感病毒重組蛋白氨基酸序列。(3)為提高甲型流感病毒重組蛋白表達量，采用大腸桿菌偏愛密碼子，將甲型流感病毒重組蛋白氨基酸序列轉換為對應的核苷酸序列。(4)化學合成上一步驟得到的核苷酸序列，并通過酶切連接，將合成得到的核苷酸片段插入表達載體PET-28a(+),構建甲型流感病毒重組蛋白表達載體。(5)甲型流感病毒重組蛋白表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，篩選得到甲型流感病毒重組蛋白表達菌株。(6)甲型流感病毒重組蛋白表達菌株大規模培養后，經超聲破菌并低溫離心，取溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱親和層析，洗脫得到純化甲型流感病毒重組蛋白。(7)純化的甲型流感病毒重組蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾臟細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，經過多輪亞克隆篩選最終得到分泌甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。(8)將雜交瘤細胞株分別制備Balb/c小鼠腹水，使用Protein A親和層析法純化單克隆抗體，并分別標記膠體金顆粒。(9)正交實驗篩選顯示4C10單抗包被與3D7單抗標記配對為最佳檢測甲型流感病毒組合。

設計方案1：一種甲型流感病毒重組蛋白，該重組蛋白質的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。

設計方案2：一種甲型流感病毒重組蛋白，該重組蛋白質的氨基酸序列包含如序列表SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示氨基酸序列。

設計方案3：一種核苷酸序列，該核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示，可編碼權利1-2所述的甲型流感病毒重組蛋白。

設計方案4：一種質粒載體，該質粒載體含有權利要求3所述的核苷酸序列。

設計方案5：一種菌株，該菌株包含采用權利要求4所述的質粒載體。

本發明與背景技術相比，一是采用大腸桿菌偏愛密碼子優化甲型流感病毒重組蛋白對應的核苷酸序列，從而大大提高了甲型流感病毒重組蛋白在大腸桿菌中的表達水平；二是作為免疫原的甲型流感病毒重組蛋白僅含有甲型流感病毒特有的優勢抗原表位，保證了最終得到的單克隆抗體僅特異性識別甲型流感病毒核蛋白，并篩選得到了最優單抗配對組合，提高了檢測靈敏度；三是免疫原含有的優勢抗原表位是不同亞型甲型流感病毒核蛋白的共有抗原表位，保證了檢測廣譜性，避免漏檢。

具體實施方式

以下實施例雖然對本發明的設計思路作了比較詳細的文字描述，但是這些文字描述，只是對本發明設計思路的簡單文字描述，而不是對本發明設計思路的限制，任何不超出本發明設計思路的組合、增加或修改，均落入到本發明的保護范圍內。

實施例1：甲型流感病毒核蛋白優勢抗原表位選擇

以甲型流感病毒核蛋白為靶抗原，利用生物軟件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的親水性及抗原性，選擇A優勢抗原表位(SEQ ID No:2)和B優勢抗原表位(SEQ ID No:3)。同時，序列比較結果顯示所選擇的A、B兩個優勢抗原表位序列具備廣譜性，是所有甲型流感病毒核蛋白共有表位；并且A、B表位與其它蛋白序列無明顯同源性，僅存在于甲型流感病毒核蛋白序列。

實施例2：甲型流感病毒核蛋白優勢抗原表位的串聯

為增強所選擇抗原表位對小鼠免疫系統的激活效果以縮短單克隆抗體制備時間，將甲型流感病毒核蛋白A、B兩個優勢抗原表位序列分別重復后再通過柔性片段(連續四個甘氨酸)連接,得到重組蛋白氨基酸序列，其具體序列如序列表SEQ ID No:1所示。

實施例3：優化編碼甲型流感病毒重組蛋白的核苷酸序列

在甲型流感病毒重組蛋白氨基酸序列不變的前提下,為了提高甲型流感病毒重組蛋白在大腸桿菌中的表達量，根據大腸桿菌偏愛密碼子將編碼甲型流感病毒重組蛋白的氨基酸序列轉化為對應的核苷酸序列，具體序列如序列表SEQ ID No:4所示，并在其上下游分別添加酶切位點BamHI和EcoRI對應的核苷酸序列后，由杭州賢至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因連接于pMD20-T載體(寶生物工程大連有限公司)中。

實施例4：構建甲型流感病毒重組蛋白表達載體

將含目的基因的pMD20-T載體和PET-28a(+)載體(德國Novagen公司)通過限制性內切酶BamHI和EcoRI(寶生物工程大連有限公司)分別于37℃雙酶切12小時，酶切產物分別進行1％瓊脂糖凝膠電泳，并分別切膠回收目的基因和PET-28a(+)載體(本發明所使用的膠回收試劑盒均來自寧波中鼎生物技術有限公司)。使用T4連接酶(寶生物工程大連有限公司)將回收的目的基因和PET-28a(+)載體按一定的比例于4℃連接12小時后，連接產物轉化DH5α感受態細胞(杭州賢至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒溫培養12小時之后，于平板上挑取單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養基，37℃恒溫搖床培養12小時后，采用質粒純化試劑盒(本發明所使用的質粒純化試劑盒均來自于寧波中鼎生物技術有限公司)提取質粒，經BamHI和EcoRI雙酶切鑒定后得到正確的重組表達載體。

實施例5：構建甲型流感病毒重組蛋白表達菌株

將構建好的重組表達載體轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃過夜培養。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養基，37℃恒溫搖床培養8小時后，加誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(終濃度為1.0mmol/L)誘導表達4個小時后制備蛋白電泳樣品。13.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明甲型流感病毒重組蛋白成功表達，得到甲型流感病毒重組蛋白表達菌株。

實施例6：純化甲型流感病毒重組蛋白

接種甲型流感病毒重組蛋白表達菌株至LB液體培養基，加卡那青霉素至終濃度為50μg/mL，37℃恒溫搖床培養8小時后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液體培養基將該菌按1：100比例稀釋后，分裝至細菌培養瓶中，置37℃恒溫搖床培養至OD600＝0.8，加誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷至終濃度為1.0mmol/L，繼續培養誘導4小時。離心收集菌體后，4度低溫超聲破菌，低溫離心后取上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱,經洗滌、洗脫最終得到純化甲型流感病毒重組蛋白。

實施例7：雜交瘤細胞株構建

取4-6周齡雌性Balb/c小鼠，基礎免疫每只小鼠皮下多點注射福氏完全佐劑乳化的100μg甲型流感病毒重組蛋白，共400ul/只。20天后進行第二次加強免疫，方法為取80ug甲型流感病毒重組蛋白用福氏不完全佐劑乳化，共400ul/只，皮下多點注射。第三次加強免疫在15天以后，方法同第二次加強免疫相同。20天后，取120μg甲型流感病毒重組蛋白腹腔加強注射，于72小時后，眼眶取血，并處死小鼠，取其脾臟制備細胞懸液，細胞計數，按1/5于脾細胞的數量取生長狀態良好的sp2/0(小鼠骨髓瘤細胞)，混和離心后，加入聚乙二醇(Sigma公司)使二者融合。另外，再加入等體積的飼養細胞，混勻后分置于96孔細胞板(200μL/孔)，于37℃、5％二氧化碳培養箱培養。5天后，半保留換液，10天后采用間接酶聯免疫吸附法檢測96孔細胞培養板中培養雜交瘤細胞的上清。具體方法如下：

甲型流感病毒重組蛋白經包被液稀釋后(終濃度為1μg/mL)，以100μL/孔加入酶標板(無錫國盛生物工程有限公司),4℃包被12小時后通過DEM-3型洗板機(中山大學達安基因股份有限公司)用洗滌液洗滌1次；加入封閉液，200μL/孔，37℃封閉1小時，洗板機洗板1次；加待檢細胞培養上清、陽性對照血清及陰性對照樣本,100μL/孔，37℃孵育35min后，洗滌液洗滌3次；加HRP(辣根過氧化物酶)標記的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30分鐘后，洗滌液洗滌四次；每孔加顯色液A和顯色液B各50μL，37℃避光顯色10分鐘后，加終止液終止反應，50μL/孔，酶標儀450nm波長空白孔校零后讀取OD值。相關溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g,加雙蒸水定容至1000mL(pH9.6)。

封閉液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g,NaH₂PO4.2H₂O 0.39g,NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

洗滌液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g,NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g,NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

顯色液A:200mg TMB溶于100mL無水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。

顯色液B:檸檬酸2.1g,Na₂HPO₄.12H₂O 71g,加雙蒸水定容至1000mL。

使用時：1mL顯色液A+1mL顯色液B+0.4μL 30％H₂O₂

終止液：2M H₂SO₄,21.7mL濃H₂SO₄加雙蒸水定容至1000mL。

對于檢測陽性的雜交瘤細胞克隆，再使用有限稀釋法進行亞克隆，挑選單個細胞培養并通過間接酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測。經過三次亞克隆，共篩選得到8株單克隆細胞株(1G6、2E8、2A6、3D7、4C10、6F5、7B2、7C6)。

實施例8：單克隆抗體制備及純化

取6-8周齡的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液體石蠟，每只500μL，3天后腹腔注射單克隆細胞(約1.2×10⁶個/只)，7-9天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水。用50ml平衡緩沖液PBS(pH＝7.4)平衡瓊脂糖親和介質Protein A層析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)，至電腦核酸蛋白檢測儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)顯示吸光度調為0。腹水12000rpm離心5分鐘，收集上清過0.45um濾器并上樣后加PBS洗滌至吸光度為0，接著用0.1M甘氨酸(pH＝3.0)洗脫，收集流出液并加入500Mm Tris-HCl(pH＝8.5)緩沖液中和至pH＝7.0左右，得到的即為單克隆抗體。

實施例9：膠體金顆粒標記單抗

取10ml 0.01％膠體金溶液加入0.2mol/L碳酸鉀溶液20uL，充分混勻后加入100ug抗體,室溫反應2小時后添加10％牛血清白蛋白(BSA)1ml，封閉處理2小時后，離心(7500rpm/min、20分鐘)，棄去上清后沉淀用1ml復溶液充分溶解，采用噴金劃膜儀(上海金標生物科技有限公司)將復溶液按照10ul/cm均勻噴涂于玻璃纖維(寬度6mm)，再置于電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)37℃靜置30分鐘。

以上述方法分別對1G6、2E8、2A6、3D7、4C10、6F5、7B2、7C6單抗進行膠體金標記。相關溶液配方如下:

0.01％膠體金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％檸檬酸溶液1.4ml，加超純水加熱溶解反應并定容至100ml。

1％氯金酸溶液：1gAuCL₃.HCl.4H₂O粉末加超純水溶解并定容至100ml。

1％檸檬酸溶液：1g檸檬酸晶體加超純水溶解并定容至100ml。

復溶液：Tris堿6.057g溶解于800ml雙蒸水，用適量HCL調節pH至8.0，加雙蒸水定容到1000ml。

實施例10：配對單抗篩選

甲型流感病毒單克隆抗體(1G6、2E8、2A6、3D7、4C10、6F5、7B2、7C6)分別經包被液稀釋后(終濃度為1mg/ml)，通過噴金劃膜儀(上海金標生物科技有限公司)按照1ul/cm將其均勻包被于硝酸纖維素膜(Sartorius)，此為T線。通過噴金劃膜儀(上海金標生物科技有限公司)將羊抗鼠溶液(終濃度為1mg/ml)按照1ul/cm均勻包被于硝酸纖維素膜，此為C線。劃膜包被結束后，將硝酸纖維素膜置于電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)37℃靜置30分鐘。

按照常規工藝將樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜、濾紙在PVC墊板上依次組裝后切成寬4mm長條，裝上試劑卡條殼并壓緊。相關溶液配方如下：

包被液：Na₂HPO₄.7H₂O 43.42g,NaH₂PO4.H₂O 5.244g,加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

甲型流感患者臨床血清樣本及正常人血清樣本,100μL/孔上樣，室溫放置15min后，通過層析讀數儀(上海捷浩科學儀器有限公司)分別讀值并計算P/N值(陽性樣本檢測值與陰性樣本檢測值的比值)，詳見表1。

表1配對單抗P/N值統計

通過上表可知，4C10單抗包被與3D7標記配對檢測甲型流感為最佳組合。

SEQ ID NO1：甲型流感病毒重組蛋白氨基酸序列；

SEQ ID NO2：甲型流感病毒核蛋白A優勢抗原表位氨基酸序列；

SEQ ID NO3：甲型流感病毒核蛋白B優勢抗原表位氨基酸序列；

SEQ ID NO4：編碼甲型流感病毒重組蛋白的核苷酸序列。

序列表

<110> 杭州賢至生物科技有限公司

<120> 一種甲型流感病毒重組蛋白及其單克隆抗體的制備

<160> 4

<210> 1

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含甲型流感病毒核蛋白優勢抗原表位

<400> 1

Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly

5 10 15

Gly Gly Gly Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys

20 25 30

Lys Thr Gly Gly Gly Gly Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp

35 40 45 50

Leu Arg Val Ser Ser Phe Gly Gly Gly Gly Trp Met Ala Cys His Ser Ala

55 60 65

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe

70 75

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Virus

<400> 2

Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr

5 10 15

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Virus

<400> 3

Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe

5 10 15

<210> 4

<211>231

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據大腸桿菌的偏愛密碼子設計

<400> 4

TATCTGGAAG AACATCCGAG CGCCGGCAAA GATCCGAAAA AAACCGGCGG 50

CGGCGGCAAA TATCTGGAAG AACATCCGAG CGCCGGCAAA GATCCGAAAA 100

AAACCGGCGG CGGCGGCTGG ATGGCCTGCC ATAGCGCCGC CTTTGAAGAT 150

CTGCGCGTGA GCAGCTTTGG CGGCGGCGGC TGGATGGCCT GCCATAGCGC 200

CGCCTTTGAA GATCTGCGCG TGAGCAGCTT T 231