香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法
【專利摘要】本發明公開一種香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法。本發明提供一組特異引物，可在一次PCR擴增反應內同時檢測香蕉枯萎病菌1號、4號生理小種，以及細菌性軟腐病菌；當PCR產物呈現636bp條帶，即樣本中含有FOC1；呈現796bp條帶，即樣本中含有FOC4；呈現218bp條帶，即樣本中含有細菌性軟腐病原菌。該方法操作簡單，耗時短，檢測靈敏度高；檢測香蕉枯萎病菌菌絲的靈敏度可達1μg，檢測細菌性軟腐病菌的靈敏度可達103CFU/ml。該方法同時可應用于香蕉患病組織、直接分離的病原菌或土壤的檢測，具有準確度高等優點，防止香蕉枯萎病和細菌性軟腐病的擴散與蔓延，保障香蕉安全生產。
【專利說明】香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農作物病害防治及植物檢疫領域，特別涉及一種香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法。
【背景技術】
[0002]香蕉是僅次于水稻、小麥和玉米的全世界第四大糧食作物；據？八0統計，近10年全世界香蕉種植面積呈增長的趨勢，2007年種植面積達6615.75萬畝，產量達到8000多萬噸，而中國的面積為450多萬畝，居第五位，產量達到700多萬噸，居第二位。但是，該產業的發展正受到病害的毀滅性威脅，特別是毀滅性病害香蕉枯萎病和細菌性軟腐病等。香蕉枯萎病的病原菌為尖抱鍵刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense FOC) (Wang ZZ et al，2006)，有4個生理小種；其中4號生理小種(F0C4)能感染幾乎所有的香蕉品種，其危害性最大(Liu J M et al，2006)。目前，F0C4已嚴重危害澳大利亞、菲律賓和我國臺灣等地的香蕉生產(漆艷香等，2008) ;1996年，廣東番禹也發現巴西香蕉感染枯萎病，并鑒定為F0C4。目前，以F0C4為主要病原菌的香蕉枯萎病在廣東省主要香蕉種植基地迅速蔓延，對香蕉產業造成重大危害。此外，FOCl也是我國香蕉枯萎病的重要病原菌，如嚴重危害我國華南香蕉產區的粉蕉的枯萎病就是由I號生理小種FOCl侵染引起的(彭埃天等，2009)；該病原菌可感染香蕉栽培種“大蜜啥”(Gros Michel (AAA))、龍牙蕉(MusaAAB)和矮香蕉(Dwarf Cavendish (AAA))等，且該生理小種呈世界性分布。香蕉細菌性軟腐病則于2009年7月廣東廣州首次發現，這是在中國大陸首次發現該毀滅性病害，田間發病率20%~30%，嚴重可達100%以上，并造成整株死亡；病原菌經鑒定為Dikeya sp.(Lin et al,2010)。但由于該病害報道時間較短，尚未有關于病害監測技術的系統報道。
[0003]該兩種病害主要通過種苗傳播，病害潛伏期長，一旦出現癥狀，香蕉已經面臨死亡狀態危害嚴重。但是，由于以下原因使得病情的判斷不準確或者耗時較長，無法制定準確的防治措施或者延誤最佳防治時機；第一，香蕉細菌性軟腐病初期發病癥狀和香蕉枯萎病有些相似，根據病狀較難判斷，而傳統的病原菌分離培養鑒定的方法耗時耗力，且同時依賴專業人員的扎實植物病理學背景；第二，香蕉枯萎病和細菌性軟腐病經常可復合感染香蕉植株，造成嚴重危害。然而，目前國內外關于香蕉主要病害的檢測技術均是單項技術，如“香蕉枯萎病菌I號和4號生理小種檢測引物和快速檢測方法”(申請號:201010181211.1)和“香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法與應用”(申請號:201110003516.8)。以上技術均只能單獨檢測香蕉枯萎病和細菌性軟腐病菌。因此，在實際農業生產中，關于香蕉重要病害檢測、監測及防治等，由于檢測過程較為耗時、耗工和耗錢，容易錯過農時，不符合生產實際要求。為防止香蕉枯萎病和細菌性軟腐病的擴散與蔓延，確保香蕉的安全生產，建立一套穩定、簡便、快速、靈敏的分子檢測方法對種苗及種植區的土壤進行檢疫檢測是非常必要的。

【發明內容】
[0004]為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法。
[0005]本發明根據香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種的基因組差異序列設計一對可同時檢測出香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種的特異引物，僅使用一對引物可同時鑒定香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種；同時，根據Dickeya屬的gyrB基因序列設計新引物，可特異檢測該屬病原菌。
[0006]該方法操作簡便易行，可以以試劑盒的形式直接應用于生產實踐，用于帶菌的植物組織或土壤的高靈敏度快速檢測，確保為生產提供健康無菌種苗、對病原菌分子預警具有十分重要的意義。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種所述香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法的應用。
[0008]香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種及香蕉細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測的方法，即利用聚合酶鏈式反應(PCR)分子生物學技術對香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種及香蕉細菌性軟腐病菌進行高靈敏度快速檢測，可用于香蕉種苗檢疫、土壤病原菌檢測、田間香蕉病害的早期診斷以及病菌的鑒定和監測。
[0009]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，包括以下步驟:
[0010](I)提供兩對檢測引物，見表1所示:
[0011]表1香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種及細菌性軟腐病菌檢測特異引物
[0012]
【權利要求】
1.一種香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟: (1)提供兩對檢測引物，如下所示: 香蕉枯萎病菌上游特異引物Foc-F:5’ -TTCGGCGATAACTTCAATGTCA-3’ ； 香蕉枯萎病菌下游特異引物Foc-R:5’ -TGGGTTGCGGATTCGCTATT-3’ ； 細菌性軟腐病菌上游特異引物GyrB-F:5’ -AATACGACATTCTGGCTAAGCG-3’ ； 細菌性軟腐病菌下游特異引物GyrB-R:5’ -GATTTCCACGCCGATATTGTCT-3’ ； (2)對樣本進行處理，抽提樣本DNA； (3)以樣本DNA為模板，使用香蕉枯萎病菌上游、下游特異引物和細菌性軟腐病菌上游、下游特異引物進行多重PCR擴增反應； (4)將擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測；當PCR產物呈現636bp條帶時，即樣本中含有香蕉枯萎病菌I號生理小種病原菌；iPCR產物呈現796bp條帶時，即樣本中含有香蕉枯萎病菌4號生理小種病原菌；當PCR產物呈現218bp條帶時，即樣本中含有細菌性軟腐病原菌。
2.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征 在于:步驟(2)中所述的樣本為香蕉病原菌時，所述處理的方式為利用FPCBsolution抽提培養過濾后的真菌菌絲的DNA ;利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA。
3.根據權利要求2所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于:所述的過濾為用擦鏡紙或濾紙進行過濾。
4.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于:步驟(2)中所述的樣本為香蕉植株組織時，所述處理的方式為利用CTAB法抽提香蕉植株組織中的DNA。
5.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于:步驟(2)中所述的樣本為土壤時，所述處理的方式為使用土壤基因組DNA快速提取試劑盒提取疑感染的土壤DNA。
6.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于:步驟(3)所述的多重PCR擴增反應的反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性40s，60。。退火 40s，72。。延伸 60s，35 個循環;72°C延伸 IOmin0
7.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于: 步驟(3)所述的多重PCR擴增反應的體系20 μ L如下:DNA模板I μ L，含Mg2+的IOXPCRbuffer2 μ L, 2.5mM 的 dNTPl.6 μ L，10 μ M 的 Foc-F0.3 μ L，10 μ M 的 Foc-R0.3 μ L，10 μ M 的GyrB-F0.3 μ L，10 μ M 的 GyrB-R0.3 μ L, 5U/ μ L 的 Taq 酶 0.2 μ L，ddH2014 μ L，共 20 μ L。
8.權利要求1~7任一項所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法應用于香蕉種苗檢疫、土壤病原菌檢測、田間香蕉病害的早期診斷以及病菌的監測和鑒定。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法應用于香蕉患病組織的檢測，患病組織上直接分離的病原真菌或細菌的鑒定及檢測 ，土壤中香蕉枯萎病菌不同生理小種、細菌性軟腐病菌的檢測。
【文檔編號】C12Q1/04GK103789443SQ201410064946
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月25日 優先權日:2014年2月25日
【發明者】林壁潤, 張景欣, 沈會芳, 蒲小明, 潘群英 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所