一種高純度α-環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種高純度α-環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法，本發明采用以下步驟實現：首先進行α-環糊精葡萄糖基轉移酶粗酶液制備、再進行發酵上清液飽和硫酸銨沉淀、進行離子交換柱層析、進行Native-PAGE電泳分離、再進行目標蛋白的電泳回收，即可得到高純度的α-環糊精葡萄糖基轉移酶酶。與現有技術相比，本發明制備出的α-環糊精葡萄糖基轉移酶的純度高且制備步驟少，生產效率高，能夠滿足環糊精工業化生產的要求，減少了環糊精后期提純的難度，使得環糊精的生產成本大大降低，極大地提高了CGTase的應用和環糊精的規?；a，具有推廣應用的價值。
【專利說明】一種高純度Cl -環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種環糊精葡萄糖基轉移酶的制備方法，尤其涉及一種高純度α -環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法。
【背景技術】
[0002]環糊精是由D-吡喃葡萄糖基以α -1, 4葡萄糖苷鍵連接而成的環狀低聚糖，其中最常見的是α -環糊精、β -環糊精、Υ -環糊精，分別由六個、七個和八個葡萄糖分子構成。環糊精分子經X射線衍射和核磁共振研究證明其具有中空圓筒狀結構，內部疏水，外部親水，可將許多化學物質包結在其環形空隙里，從而改變這些被包結物質的穩定性、溶解性、揮發性及化學反應性能等各種理化性質，因而廣泛應用于醫藥、食品、化妝品、化學分析、環保、農業、化學檢測等諸多領域；此外，經小鼠毒理學實驗已證明環糊精的使用安全性與一般的淀粉或糊精相同。因而環糊精受到了各行業尤其是化妝品、食品和醫藥行業的青睞，其全球需求量呈逐年大幅度增長。
[0003]目前，環糊精的工業化生產均采用來自芽孢桿菌屬的環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase;EC2.4.1.19)催化淀粉等相關基質來合成；不同微生物來源的CGTase性質差異較大，但普遍存在野生菌株產酶能力低、產物專一性不強和耐熱性差等缺陷，一方面導致CGTase的產量遠不能滿足環糊精工業化生產的要求，另一方面增加了環糊精后期提純的難度，使得環糊精的生產成本大大增加，極大地限制了 CGTase的應用和環糊精的規?；a。

【發明內容】

[0004]本發明的目 的就在于為了解決上述問題而提供一種高純度α -環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法。
[0005]本發明通過以下技術方案來實現上述目的:
[0006]本發明包括以下步驟:
[0007]步驟一:進行α -環糊精葡萄糖基轉移酶粗酶液制備:α -環糊精葡萄糖基轉移酶產生菌經96h發酵后，對發酵液進行離心處理，收集上清液即為粗酶液；
[0008]步驟二:進行發酵上清液飽和硫酸銨沉淀:冰浴條件下，往發酵上清液中加入已研碎的硫酸銨直至飽和度為90%，4°C冰箱放置沉淀過夜；第二天離心收集沉淀，收集的沉淀經Tris-HCl Buffer復溶后于4°C冰箱中透析除鹽；
[0009]步驟三:進行離子交換柱層析:取適量透析保留液進行DEAE-Sepharose Fastflow離子交換柱層析，離子交換柱用含0.04M NaCl的Tris-HCl Buffer平衡,用含0.1MNaCl的Tris-HCl Buffer進行洗脫，流速設定為0.5ml/min，采用部分收集器收集餾分，每3ml收集I管，碘顯色法確定具有酶活性的餾分，并對活性餾分進行冷凍干燥；
[0010]步驟四:進行Native-PAGE電泳分離:冷凍干燥樣品經最小體積的上樣緩沖液復溶后進行Native-PAGE電泳分離，電泳結束后切取部分凝膠進行R-250染色和活性染色以進行目標蛋白的定位；
[0011]步驟五:進行目標蛋白的電泳回收:確定目標蛋白在凝膠中的位置后，將包含目標蛋白的凝膠切下并放入透析袋內，往透析袋內加入適量的電極液即可進行電泳回收，期間隔幾個小時收集已電泳出來的組分，將電泳出的組分合并于透析袋內透析以去除電極液中高濃度的甘氨酸組分，透析采用磷酸鹽緩沖液(pH=6.0);透析保留液冷凍干燥即可獲得高純度的α-環糊精葡萄糖基轉移酶酶。
[0012]進一步，所述步驟一中的發酵液進行離心處理和所述步驟二中的離心收集沉淀的離心條件均為4°C、13000g離心lOmin。所述步驟四中進行Native-PAGE電泳分離的電泳條件為:分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，電泳電壓300V，電泳溫度4°C，電泳時間為6h。所述步驟五中電泳回收的電泳條件為:電壓60V，電泳溫度4°C。
[0013]本發明的有益效果在于:
[0014]本發明是一種高純度α -環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法，與現有技術相t匕，本發明制備出的α -環糊精葡萄糖基轉移酶的純度高且制備步驟少，生產效率高，能夠滿足環糊精工業化生產的要求，減少了環糊精后期提純的難度，使得環糊精的生產成本大大降低，極大地提高了 CGTase的應用和環糊精的規模化生產，具有推廣應用的價值。
【具體實施方式】
[0015]下面對本發明作進一步說明:
[0016]本發明包括以下步驟:
[0017]步驟一:進行α -環糊精葡萄糖基轉移酶粗酶液制備:α -環糊精葡萄糖基轉移酶產生菌經96h發酵后，對發酵液進行離心處理，收集上清液即為粗酶液；
[0018]步驟二:進行發酵上清液飽和硫酸銨沉淀:冰浴條件下，往發酵上清液中加入已研碎的硫酸銨直至飽和度為90%，4°C冰箱放置沉淀過夜；第二天離心收集沉淀，收集的沉淀經Tris-HCl Buffer復溶后于4°C冰箱中透析除鹽；
[0019]步驟三:進行離子交換柱層析:取適量透析保留液進行DEAE-Sepharose Fastflow離子交換柱層析,離子交換柱用含0.04M NaCl的Tris-HCl Buffer (pH8.9)平衡,用含0.1M NaCl的Tris-HCl Buffer (ρΗ8.9)進行洗脫，流速設定為0.5ml/min，采用部分收集器收集餾分，每3ml收集I管，碘顯色法確定具有酶活性的餾分，并對活性餾分進行冷凍干燥；
[0020]步驟四:進行Native-PAGE電泳分離:冷凍干燥樣品經最小體積的上樣緩沖液復溶后進行Native- PAGE電泳分離，電泳結束后切取部分凝膠進行R-250染色和活性染色以進行目標蛋白的定位；
[0021]步驟五:進行目標蛋白的電泳回收:確定目標蛋白在凝膠中的位置后，將包含目標蛋白的凝膠切下并放入透析袋內，往透析袋內加入適量的電極液即可進行電泳回收，期間隔幾個小時收集已電泳出來的組分(防止α-環糊精葡萄糖基轉移酶經長時間的電泳而發生變性)，將電泳出的組分合并于透析袋內透析以去除電極液中高濃度的甘氨酸組分，透析采用磷酸鹽緩沖液(ρΗ=6.0);透析保留液冷凍干燥即可獲得高純度的α -環糊精葡萄糖基轉移酶酶。
[0022]進一步，所述步驟一中的發酵液進行離心處理和所述步驟二中的離心收集沉淀的離心條件均為4°C、13000g離心lOmin。所述步驟四中進行Native-PAGE電泳分離的電泳條件為:分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，電泳電壓300V，電泳溫度4°C，電泳時間為6h。所述步驟五中電泳回收的電泳條件為:電`壓60V，電泳溫度4°C。
【權利要求】
1.一種高純度α-環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:進行α-環糊精葡萄糖基轉移酶粗酶液制備:α -環糊精葡萄糖基轉移酶產生菌經96h發酵后，對發酵液進行離心處理，收集上清液即為粗酶液； 步驟二:進行發酵上清液飽和硫酸銨沉淀:冰浴條件下，往發酵上清液中加入已研碎的硫酸銨直至飽和度為90%，4°C冰箱放置沉淀過夜；第二天離心收集沉淀，收集的沉淀經Tris-HCl Buffer復溶后于4°C冰箱中透析除鹽； 步驟三:進行離子交換柱層析:取適量透析保留液進行DEAE-Sepharose Fast flow離子交換柱層析，離子交換柱用含0.04M NaCl的Tris-HCl Buffer平衡，用含0.1M NaCl的Tris-HCl Buffer進行洗脫,流速設定為0.5ml/min,采用部分收集器收集懼分,每3ml收集I管，碘顯色法確定具有酶活性的餾分，并對活性餾分進行冷凍干燥； 步驟四:進行Native-PAGE電泳分離:冷凍干燥樣品經最小體積的上樣緩沖液復溶后進行Native-PAGE電泳分離，電泳結束后切取部分凝膠進行R-250染色和活性染色以進行目標蛋白的定位； 步驟五:進打目標蛋白的電泳回收:確定目標蛋白在凝月父中的位直后，將包含目標蛋白的凝膠切下并放入透析袋內，往透析袋內加入適量的電極液即可進行電泳回收，期間隔幾個小時收集已電泳出來的組分，將電泳出的組分合并于透析袋內透析以去除電極液中高濃度的甘氨酸組分，透析采用磷酸鹽緩沖液；透析保留液冷凍干燥即可獲得高純度的α-環糊精葡萄糖基轉移酶酶。
2.根據權利要求1所述的高純度α-環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法，其特征在于:所述步驟一中的發酵`液進行離心處理和所述步驟二中的離心收集沉淀的離心條件均為 4°C、13000g 離心 IOmin0
3.根據權利要求1所述的高純度α-環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法，其特征在于:所述步驟四中進行Native-PAGE電泳分離的電泳條件為:分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，電泳電壓300V，電泳溫度4°C，電泳時間為6h。
4.根據權利要求1所述的高純度α-環糊精葡萄糖基轉移酶的簡單制備方法，其特征在于:所述步驟五中電泳回收的電泳條件為:電壓60V，電泳溫度4°C。
【文檔編號】C12N9/10GK103820413SQ201410076463
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月4日 優先權日:2014年3月4日
【發明者】陳濟琛, 林新堅, 葉學軍, 林陳強, 張慧 申請人:福建省農業科學院土壤肥料研究所