一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
【專利摘要】本發明提供了一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法和一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒及其構建方法和應用。本發明提供的胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒包括胱氨酸轉運系統底物結合蛋白基因fliY序列和一段合適的載體片段；這種方法的原理在于：通過在合適時間添加誘導劑使fliY表達而提高半胱氨酸利用率；最終發酵產物中谷胱甘肽的合成量顯著高于原始菌株，提高了原料利用率，可為進一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎模型。除此之外，該方法及思路可以用于其他因原料利用率低限制產量提高的目的產物，為生產有價值的產品提供了新的思路。
【專利說明】一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，具體地說，是關于一株提高半胱氨酸利用率的菌株高產谷胱甘肽的方法。
【背景技術】
[0002]谷胱甘肽(Y-L-glutamyl-cysteinyl-glycine, GSH)是細胞內重要的抗氧化劑和主要的非蛋白巰基化合物。在大部分動物、植物和微生物的細胞與組織中，谷胱甘肽以氧化型和還原型兩種形式存在，兩者通過谷胱甘肽還原酶保持動態平衡從而使還原型谷胱甘肽發揮有效的生化反應。例如:谷胱甘肽通過還原，共軛或與其他非酶抗氧化劑協同以發揮抗氧化作用，清除內生或外源的氧化物質和親電子體，維持內環境氧化還原穩態并起到細胞保護作用；作為輔酶參與氨基酸轉運與代謝(如Y-谷氨酰基循環)，保持抗壞血酸復位狀態并形成脫氧核糖核酸類物質和一些小分子化合物(如半胱氨酸，甘氨酸，谷氨酸)；此外，谷胱甘肽間接調控DNA的合成，從而調節細胞乃至組織的生長和死亡，進而對抗或誘發腫瘤，免疫缺陷，心血管疾病，肝腎疾病或神經性疾病。鑒于此，谷胱甘肽大量應用于醫藥保健，護膚美容，食品添加等行業。
[0003]目前GSH的生產方法主要有溶劑萃取法、化學合成法和生物酶催化法和生物發酵法。相比之下，生物發酵法具有反應條件溫和、反應步驟簡單、成本低、轉化效率高、生產速率快等優勢，是今后生產谷胱甘肽的主要趨勢，但目前大部分研究還停留在實驗室階段，實現商業化生產的國家主要是日本。
[0004]近年來基于發酵法對GSH產量提高的方法漸漸由傳統的育種策略，培養條件優化和控制轉向對代謝的調控和分子機制的研究，一些數理知識的引入在發酵條件優化，發酵過程控制及動力學模型的建立上起著重要作用，近來分子生物學的發展也為研究者從分子水平探究、提高GSH產量提供了新思路。L-半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前體氨基酸之一，細胞內L-半胱氨酸的供應不足嚴重影響了谷胱甘肽的合成速度及產量。因此可以采用分子生物學方法使L-半胱氨酸大量進入細胞，最終使細胞內谷胱甘肽的合成量增加。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于，提供一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒，以用于構建表達胱氨酸轉運系統底物結合蛋白的菌株。
[0006]本發明還有一個目的在于，提供一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒的構建方法。
[0007]本發明還有一個目 的在于，提供一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒的應用。
[0008]本發明還有一個目的在于，提供一種過表達胱氨酸轉運系統底物結合蛋白生物合成谷胱甘肽的方法。
[0009]本發明提供的胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒包括胱氨酸轉運系統底物結合蛋白基因fliY序列和一個合適的載體片段；所述序列fliY如NCBI上Gene ID為948833的序列所不。
[0010]根據本發明的一個優選實施例，在胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒中，fliY連接在一個合適的載體上，通過合適的誘導劑誘導，從而使fliY過量表達，進而使合成谷胱甘肽的前體氨基酸之一半胱氨酸可以大量的進入細胞，最終使細胞內谷胱甘肽的合成量增加。
[0011]根據本發明的另一個優選實施例，所述胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒包括一個卡那霉素抗性基因，用以篩選基因重組菌。
[0012]本發明提供的谷胱甘肽合成酶系重組質粒的構建方法包括以下步驟:
[0013]A)PCR擴增獲得fliY序列；
[0014]B)將 fliY 序列克隆入 pET28a。
[0015]本發明提供的胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒可用于構建表達胱氨酸轉運系統底物結合蛋白的菌株。
[0016]本發明提供的方法可用于合成谷胱甘肽。
[0017]本發明提供的合成谷胱甘肽的方法通過發酵培養本發明提供的胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組菌株，合成谷胱甘肽。
[0018]使用本發明提供的質粒可以構建合成谷胱甘肽大腸桿菌，可以明顯地提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生產量，降低了成本和能耗，可為進一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎模型。除此之外，該方法構建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率低限制產量提高的目的產物，為生`產有價值的產品提供了新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是PCR擴增獲得的fliY的凝膠電泳檢測結果，其中泳道I為fliY。
[0020]圖2是BL21_f IiY質粒雙酶切的凝膠檢測結果，其中泳道I中5350bp左右的條帶為質粒
[0021]pET-28a(+)的DNA片段，800bp左右的條帶為基因fliY的DNA片段。
[0022]圖3是質粒pET28a_fliY的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0023]以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。
[0024]以下實施例中為注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆:實驗室手冊》(New York:CoLd Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或廠商提供的方案進行。
[0025]在本發明的下述實施例中，使用的膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒均購自生工生物公司。
[0026]在本發明的下述實施例中，使用的pMD-19TSimpLe Vector,Hind III,EcoR I,TaqDNA聚合酶，T4DNA連接酶，DNA Marker,均購自TAKARA公司。
[0027]在本發明的下述實施例中，使用的表達載體pET28a、菌種E.coli BL21(DE3)、菌種E.coli K12、E.coli DH5 α，為中國藥科大學生命中心實驗室保存，其中菌種E.coliBL21 (DE3)的 ATCC 編號為 BAA-1025?。
[0028]在本發明的下述實施例中，使用的E.coli BL21(DE3)感受態細胞、E.coli DH5 α感受態細胞，購自天根生化科技有限公司。
[0029]在本發明的下述實施例中，使用的LB培養基的配方為:1%胰蛋白棟，0.5%酵母浸粉，1% NaCl ;使用的搖瓶發酵培養基的配方為:1%胰蛋白棟，0.5%酵母浸粉，i%NaCl。配置固體LB平板培養基時，按照上述配方添加2%瓊脂粉。
[0030]在本發明的下述實施例中，感受態細胞的制備和轉化，按照《分子克隆:實驗室手冊》提供的方法進行。
[0031]實施例1表汰質粒的構律
[0032]1.1引物設計
[0033]根據NCBI報道的fliY序列，設計以下2條引物:
[0034]fIiYUP:GAGGAATTCATGAAATTAGCACATCTGGGA ；
[0035]fIiYDOffN:GCCAAGCTTTTATTTGGTCACATCAGCAC。
[0036]其中fliYUP和fliYDOWN用于擴增fliY編碼區；fliYUP、fIiYDOWN上的下劃線表示在fliYUP、fIiYDOWN上分別引入的EcoR1、Hind III酶切位點。
[0037]1.2PCR 擴 增 fliY 序列
[0038]抽提得到大腸桿菌E.coli K12基因組。
[0039]以大腸桿菌E.coli K12基因組為模板，分別以步驟1.1中設計的fliYUP和fliYDOffN為引物對，進行PCR擴增，具體如下:
[0040]擴增fliY 的反應體系均為:10XPCR Buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMgS042 y L，上下游引物(10 μ M)各 lyL’E.coli BL21(DE3)基因組 DNAl μ L，Taq DNA 聚合酶I μ L，加入去離子水，至體系總體積為50 μ L。
[0041]擴增fliY 的反應條件:95°C 4min ；95 °C 30s，56°C 40s, 72 °C lmin，34 個循環；72°C IOmin。
[0042]PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示。根據圖1的結果，獲得的產物的大小為801bp，符合fliY產物的預期大小。
[0043]1.3表達載體的構建
[0044]1.3.1構建預處理
[0045]使用膠回收試劑盒純化步驟1.2中獲得的PCR產物，然后和pMD-19T SimpLe載體，用T4DNA連接酶，于16°C連接過夜，反應體系如下:
[0046]4 μ L 的 PCR 產物，I μ LpMD-19Τ SimpLe 載體，5 μ L T4DNA 連接酶。
[0047]連接產物轉化大腸桿菌DH5 α并涂布含有50 μ g/mL氨芐青霉素的固體LB平板，37°C培養至轉化子長出。其中E.coli DH5a是無氨芐青霉素抗性菌株，不能在含有氨芐青霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉化子均為轉化了 pMD-fIiY質粒的大腸桿菌。挑取轉化子鑒定，根據鑒定結果，最終獲得質粒pMD-fliY。
[0048]質粒pMD-fIiY經測序驗證，包含fliY編碼區(fliY編碼區序列分別如SQ ID N0.1所示)，而且編碼區無氨基酸殘基突變。
[0049]1.3.2表達載體的構建[0050]將1.3.1中雙酶切產物fliY凝膠回收純化，分別與EcoR I/Hind III雙酶切的表達載體pET28a連接，將連接產物分別轉化入宿主菌E.coli DH5 α，并涂布含有100 μ g/mL卡那霉素固體LB平板，37°C培養至轉化子長出。其中E.coli DH5 α是無卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉化子均為轉化了 pET28a-fliY質粒的大腸桿菌。挑取轉化子鑒定，根據鑒定結果，最終獲得質粒pET28a-fliY0
[0051]質粒pET28a_fliY的雙酶切鑒定:提取陽性克隆的質粒pET28a_fliY，并用EcoRI/Hind III 進行雙酶切，酶切體系為:EcoR Il μ L, Hind IIIl μ L，質粒 pET28a_fliY8 μ L，IOXK Buffer2yL，補水至20yL。37°C酶切4小時，將酶切產物凝膠電泳，結果如圖2。根據圖2的結果，獲得的產物的大小分別為800bp和5350bp的DNA片段，符合fliY產物的預
期大小。
[0052]質粒pET28a_fliY經測序,并對測序結果進行分析獲得pET28a_fliY質粒的結構示意圖，結果如圖3所示。該質粒中包含fliY編碼區(fliY編碼區序列SQ ID N0.1所示)，其中fliY編碼區置于T7啟動子、Lac操縱子之下，而且編碼區無氨基酸殘基突變。
[0053]實施例2表達質粒轉化合成谷胱甘肽細菌株
[0054]將1.3.2中得到的帶有質粒pET28a_fliY的大腸桿菌，抽提質粒并轉化入宿主菌E.coli BL21(DE3)，并涂布含有60μg/mL卡那霉素的固體LB平板，37°C培養至轉化子長出。其中E.coli BL21 (DE3)是無卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉化子均為轉化了 pET28a-f IiY質粒的大腸桿菌。
[0055]分別隨機挑取若干含pET28a_fliY質粒的轉化子，搖瓶發酵培養，并選取一株谷胱甘肽合成量較高的大腸桿菌菌株，命名為BL21-fliY。
[0056]抽提BL21-f I iY的質粒DNA，分別以引物f I iYUP和f I iYDOffN對上述抽提物進行PCR擴增，獲得了長度為0.Skb的片段。經測序驗證，fliY的表達框已插入質粒pET28a-fliY0
[0057]根據上述結果，質粒pET28a_fliY已成功轉化入宿主菌E.coli BL21 (DE3)，命名為 BL21-fliY0
[0058]實施例3BL21_fliY和E.coli BL21 (DE3)搖瓶發酵谷胱甘肽
[0059]將于37°C固體LB平板上生長過夜的BL21-fliY和E.coli BL21(DE3)(原始菌，命名為BL21)的單菌落，分別接入液體LB培養基中，搖瓶培養過夜。
[0060]分別取適量菌液轉接入搖瓶發酵培養基，培養llh。其中，在適當時間加入誘導劑；適時添加合適濃度的半胱氨酸并于發酵的Ilh取樣，檢測發酵產物中谷胱甘肽的合成量，結果表明本發明構建的BL21-fliY工程菌產谷胱甘肽達522.7mg/L發酵液，遠遠高于對照組E.coli BL21 (DE3)產谷胱甘肽193.7mg/L發酵液。
[0061]綜上所述，使用本發明提供的質粒可以轉化累積谷胱甘肽的原始細菌株，獲得的重組菌發酵培養，發酵產物中谷胱甘肽合成量顯著高于合成谷胱甘肽的原始細菌株
E.coliBL21 (DE3)。這說明采用本發明提供的生物合成方法，可以明顯的提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生產量，降低了成本和能耗，可為進一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎模型。除此之外，該方法構建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率不高限制產量提高的目的產物，為生產有價值的產品提供了新的思路。[0062]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然，本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，`均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒，其特征在于，重組質粒由胱氨酸轉運系統底物結合蛋白基因fliY序列和一段合適的載體片段連接而成，所述fliY序列如NCBI上Gene ID為948833的序列所示，載體片段為pET28a。
2.如權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述fliY序列分別置于T7啟動子、Lac操縱子之下。
3.如權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述fliY序列為來源于E.coli K12的fliY基因。
4.如權利要求1或2所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒還包括一段抗性基因片段一卡那霉素抗性基因。
5.如權利要求1-4中任一項所述的重組質粒的構建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: A)PCR擴增獲得fliY序列； B)將fliY序列克隆到合適的表達載體。
6.如權利要求1-4中任一項所述的重組質粒用于轉化合成谷胱甘肽的原始細菌株大腸桿菌E.coli BL21(DE3)的應用。
7.一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述方法為，將權利要求1-4中任一項所述的重組質粒轉化合成谷胱甘肽原始細菌株大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，獲得重組菌。·
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，通過發酵培養所述重組菌，并在發酵培養一定時間后，用誘導劑乳糖誘導胱氨酸轉運系統底物結合蛋白基因fliY的表達，提高半胱氨酸利用率，進一步提高谷胱甘肽的合成量。
【文檔編號】C12N1/21GK103849639SQ201410116362
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】許激揚, 卞筱泓, 劉榮, 趙玉成, 沃龍飛, 張雪霞 申請人:中國藥科大學