一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗和制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首先提供一種用于弓形蟲感染預(yù)防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列：1）序列表中SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列；2）與1）中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；3）對上述1）或2）所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預(yù)防功能的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的質(zhì)粒DNA疫苗pVAX-HSP60可有效地預(yù)防和控制弓形蟲動物模型（昆明鼠）的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質(zhì)粒pVAX-HSP60能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
【專利說明】一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗和制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種呈世界性分布的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,具有十分廣泛的宿主范圍，能感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有的所有溫血動物。該病原能夠通過先天性或獲得性途徑感染宿主，絕大多數(shù)感染為隱性感染，并不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀；但對于惡性腫瘤、器官移植及艾滋病患者等免疫抑制及免疫缺陷人群卻是主要的致死病因。
[0003]在人類感染群體中，孕婦的發(fā)病率較高，且危害嚴(yán)重。弓形蟲可通過胎盤屏障垂直傳播給胎兒，常引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、畸胎、死胎等不良癥狀，而且存活的胎兒也常伴有先天性疾病，如:智力障礙、弓形蟲性腦膜腦炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和/或弓形蟲眼病等。在畜禽感染群體中，弓形蟲感染可引起體溫升高、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致母畜早產(chǎn)、流產(chǎn)或死胎，并能和其他病原微生物 協(xié)同作用，造成嚴(yán)重的公共安全問題并會給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此防控弓形蟲病已刻不容緩。由于在臨床上常用的磺胺、嘧啶類藥物防治弓形蟲病時對人和動物的毒副作用較大，且容易復(fù)發(fā)，不能殺死包囊，并往往形成藥物殘留等問題，因此疫苗防治弓形蟲病成為控制該病流行最有效的措施之一。因DNA疫苗可誘發(fā)機體全身性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答而成為抗弓形蟲疫苗研究的熱點，而且這種有效的體液免疫免疫應(yīng)答產(chǎn)生的特異性抗體，CD4+依賴的輔助性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)和CD8+依賴的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答是在抗弓形蟲感染動物模型中的重要因素。
[0004]目前，國內(nèi)外學(xué)者對弓形蟲DNA疫苗的研究主要集中于一些與弓形蟲入侵宿主和致病毒力因子上，如:弓形蟲棒狀體蛋白(rhoptry protein, R0P)包括ROPl和R0P2，R0P18, R0P16,和 R0N4 等，致密顆?？乖?dense granules antige, GRA)包括 GRA4, GRA6和GRA7等，微線體蛋白(microneme protein, MIC)包括MIC4, MIC8和MIC6等，以及膜表面抗原(surface antige, SAG)如:SAGl等。通過對這些疫苗候選抗原進(jìn)行的免疫保護(hù)性的探索研究表明，它們都具有免疫原性并能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答以抵抗弓形蟲的攻擊感染，具有一定的免疫保護(hù)力，但是并沒有達(dá)到所期望的完全保護(hù)性效果。究其原因，由于弓形蟲生活史復(fù)雜，形態(tài)多樣，宿主范圍廣泛，不同性質(zhì)的抗原其免疫原也不同，而其包囊和速殖子的致病機制也存在差異，雖然能找到各種不同的單一抗原成分為基礎(chǔ)的疫苗候選抗原，但是由于其含有的淋巴細(xì)胞結(jié)合位點少、受機體主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibility complex, MHC)限制性大,而難以形成有效的抵抗力對抗弓形蟲不同形態(tài)的攻擊感染。因此僅靠這些少數(shù)的候選抗原基因也很難達(dá)到理想的效果，而找到更多的，更好的來源于不同弓形蟲階段的DNA疫苗候選抗原，尤其是與弓形蟲毒力相關(guān)的抗原基因是研究抗弓形蟲疫苗的一個重要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗和制備方法及其應(yīng)用。
[0006]熱休克蛋白，通常又稱為熱應(yīng)激蛋白，是生物體在不利的環(huán)境因素刺激下應(yīng)激合成的一組特殊的蛋白質(zhì)，在免疫系統(tǒng)中扮演分子伴侶角色，在抗原經(jīng)典遞呈與交叉遞呈途徑、巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的活化以及樹突狀細(xì)胞的活化成熟中發(fā)揮重要作用。HSP蛋白家族成員參與弓形蟲的多個生物學(xué)過程，是其重要的毒力因子。弓形蟲熱休克蛋白60 (heatshock protein60,TgHSP60)是熱休克蛋白60亞家族的一員。該蛋白高度保守,定位于弓形蟲的線粒體中，是宿主抗原遞呈細(xì)胞活化的信號，能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞因子的釋放和刺激免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，且具有分子伴侶的作用，而且可通過Toll樣受體4(Toll_like receptor4)介導(dǎo)宿主的先天性免疫應(yīng)答以及細(xì)胞因子的釋放。因此，弓形蟲HSP60有望成為理想的疫苗候選抗原。
[0007]本發(fā)明提供一種用于弓形蟲感染預(yù)防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列:
[0008]I)序列表中SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列；
[0009]2)與I)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；
[0010]3)對上述I)或2)所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預(yù)防功能的核苷酸序列。
[0011]本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組蛋白，其氨基酸序列由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼。
[0012]優(yōu)選地，所述重組蛋白的氨基酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2。
[0013]本發(fā)明的第三個目的是提供一種重組載體，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
[0014]本發(fā)明的第四個目的是提供一種重組質(zhì)粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列。
[0015]本發(fā)明的第五個目的是提供一種疫苗，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
[0016]本發(fā)明的第六個目的是提供上述的核苷酸序列、重組蛋白、重組載體、重組質(zhì)粒、疫苗在弓形蟲感染預(yù)防中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的第七個目的是提供一種上述的疫苗的制備方法，步驟如下:
[0018](I)提取弓形蟲RH株總RNA;
[0019](2) RT-PCR 擴(kuò)增 RH 株總 RNA ；
[0020](3)將步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接；
[0021](4) pVAX I質(zhì)粒的小量提取；
[0022](5)回收pVAX I載體及目的片段HSP60 ；
[0023] (6)連接pVAX I載體與目的片段HSP60 ；
[0024](7)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌中。
[0025]優(yōu)選地，所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時所用引物為:
[0026]上游引物:5'-GGTACCATGCTTGCCCGCGCTTCAGC-3'；
[0027]下游引物:5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAGTACATGCCTCCCATGCCGC-3'。[0028]優(yōu)選地，所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min，94°C變性Imin, 60.4°C復(fù)性45s ;72°C延伸2min ；35個循環(huán)，最后，72°C延伸IOmin0
[0029]本發(fā)明的質(zhì)粒DNA疫苗pVAX-HSP60可有效地預(yù)防和控制弓形蟲動物模型(昆明鼠)的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質(zhì)粒PVAX-HSP60能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中: [0031]圖1是pVAX-HSP60構(gòu)建路線；
[0032]圖2是弓形蟲RH株死亡情況；
[0033]圖3 是 pMDl8_T 質(zhì)粒；
[0034]圖4 是 pVAXI 質(zhì)粒。
【具體實施方式】
[0035]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0036]本發(fā)明中實驗材料購自:
[0037]雌性KM鼠，6w齡左右，體重20±2g，購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心。
[0038]宿主菌，弓形蟲RH、PRU株，pVAX I真核表達(dá)載體等材料，均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲功能基因組學(xué)研究室保存并提供。
[0039]PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 (貨號:RR055B)、10XPCR Buffer(Mg2+free)>MgCl2 (25mmol/L)、dNTP Mixture (2.5mmol/L each)、Ex_Taq (5U/ μ L)(貨號:DDR100D)、pMD18-T Vector (貨號:D103A)、BamH I (貨號:D1010A)、XhoI (貨號:D1094A)、KpnI (貨號:D1068A)、PstI (貨號:D1073A)、XbaI (貨號:D1093A)、10XM BufferUOXKBuffer、10 X 6 X Loading Buffer:購自 TaKaRa 公司；
[0040]Wizard? SV Genomic DNA Purification System (貨號:A2360)、Tris-Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4DNA 連接酶:購自 Promega 公司；
[0041]RNAprep Pure Tissue Kit (貨號:DP431)、TIANprep Mini Plasmid Kit (貨號:DP103-02)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(貨號:貨號:DP209_02)、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(貨號:DP204-02):購自天根生化科技(北京)有限公司；
[0042]氨節(jié)青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、瓊脂糖:購自Sigma公司；
[0043]其他化學(xué)試劑如NaCl、、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。
[0044]一、弓形蟲RH株pVAX-HSP60疫苗的制備方法如下:
[0045]1.弓形蟲RH株總RNA的提取:將弓形蟲RH株腹腔接種KM鼠，96h后，經(jīng)頸椎脫臼致死，無菌收集小鼠腹水1.0mL,在10000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心3~5min，棄上清，備用。用天根生化科技(北京)有限公司的試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形蟲RH株總RNA，提取的具體方法和步驟參見說明書。
[0046]2.RT-PCR擴(kuò)增:以所提取的弓形蟲RH株總RNA為模板，用大連寶生物工程公司PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒進(jìn)行 HSP60 基因的 RT-PCR 擴(kuò)增，使用方法參見說明書。其中，
[0047]上游引物:FHSP60:5' -GGTACCATGCTTGCCCGCGCTTCAGC-3'；
[0048]下游引物:RHSP60:5' -AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAGTACATGCCTCCCATGCCGC-3'；
[0049]PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min，94°C變性lmin，60.4 °C復(fù)性45s ;72 °C延伸2min ；35個循環(huán)，最后，72°C延伸IOmin0
[0050]3.PCR純化產(chǎn)物的連接:將步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD18連接，連接反應(yīng)使用TaKaRa公司pMD?18_T Vector，使用方法參見說明書，連接條件為16°C反應(yīng)2~4h或4°C連接過夜，連接產(chǎn)物標(biāo)記為PMD18-HSP60。
[0051]4.HSP60的序列測定:將經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定均為陽性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果參見序列表中SEQ ID N0.1，其編碼的蛋白序列參見序列表中 SEQ ID N0.2。
[0052]5.pVAX I質(zhì)粒的小量提取:用天根生化科技(北京)有限公司TIANprep MiniPlasmid Kit進(jìn)行pVAX I質(zhì)粒提取,使用方法參照說明書。
[0053]6.pVAX I載體(圖4所示)及目的片段HSP60的回收:用Kpn I和Not I分別雙酶切pVAX I質(zhì)粒及pMD18-HSP60重組質(zhì)粒，并用天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體及目的片段，使用方法參照說明書。
[0054]7.pVAX I載體與目的片段HSP60的連接:將經(jīng)切膠回收純化得到的HSP60基因片段定向亞克隆至PVAX I載體中。16 °C反應(yīng)4~6h或4°C連接過夜，產(chǎn)物標(biāo)記為pVAX_HSP60。其核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.3。
[0055]8.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與鑒定:將連接產(chǎn)物10 μ L轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α中，挑取若干單菌落作菌液PCR鑒定。產(chǎn)物標(biāo)記為pVAX-HSP60。pVAX_HSP60構(gòu)建路線見圖1。
[0056]二、培養(yǎng)基和溶液的配制:
[0057]a、溶液的配制:
[0058](I) LB液體培養(yǎng)基
[0059]稱取LB粉末5.0g，加適量的去離子水溶解，并定容至200mL，121°C高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0060](2) LB固體培養(yǎng)基
[0061]于LB液體培養(yǎng)基中加入2.0% (m/V)瓊脂粉，121°C高壓滅菌20min，待其冷卻到55°C~65 °C時傾注平板，待凝固后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0062](3 ) Kan+LB選擇液體培養(yǎng)基
[0063]待(I)中制備的LB液體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至50°C~55°C時，加入Kan (卡那霉素)(終濃度為1000IU/mL)，搖晃混勻后4°C保存。
[0064](4 ) Kan+LB固體選擇培養(yǎng)基
[0065]待(2)中制備的LB固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50°C~55°C時，加入Kan (終濃度為1000IU/mL)并輕輕搖動，混勻后迅速傾注平板，室溫凝固并于4°C保存?zhèn)溆谩?[0066]b、質(zhì)粒大量提取時溶液的配制:[0067](1)0.25mol/L Tris-Cl 溶液(ρΗ8.0)
[0068]稱取Tris-Cl粉末6.055g，并將其溶解到IOOmL ddH20中，調(diào)節(jié)pH值為8.0，定容到200mL，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0069] (2) 0.5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8.0)
[0070]稱取Na2EDTA37.22g，溶于200mL ddH20中，振蕩混勻，調(diào)節(jié)pH值為8.0,高壓滅菌后4 C保存?zhèn)溆谩?br> [0071](3) TE 溶液(pH8.0)
[0072]先將(I)中制備的0.25mol/L Tris-Cl溶液和(2)中制備的0.5mol/L EDTA溶液(ρΗ8.0)稀釋，并分別吸取 10mmol/L Tris-Cl 1.0mL 與 lmmol/L EDTA0.2mL，加入無菌ddH20后定容到100mL，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0073](4) 10%SDS 溶液(pHL 2)
[0074]稱取SDS (十二烷基磺酸鈉)粉末10g，加入去離子水90mL后60°C水浴溶解，用濃HCl將其pH值調(diào)為7.2，并定容到IOOmL,現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜長期保存。
[0075](5) 2moI/L NaOH 溶液
[0076]先于燒杯中加入去離子水160mL，稱取NaOH粉末16.0g并緩緩加入到去離子水中，邊加邊混勻，定容到200mL后于塑料瓶中4°C保存。
[0077](6) Solution I
[0078]取(I)中制備的0.25mol/L Tris-CllOmL，(2)中制備的 0.5mol/LEDTA2mL，加去離子水定容到lOOmL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0079](7) Solution II
[0080]取2mol/L NaOHlOmL, 10%SDS10mL，加去離子水定容到IOOmL,現(xiàn)配現(xiàn)用，常溫保存，不宜長時間存放。
[0081](8) Solution III
[0082]稱取KAc粉末58.884g，與冰乙酸23mL混合，加入適量去離子水溶解后定容到200mL，4°C 保存。
[0083](9) 3mol/L NaAc 溶液(ρΗ5.2)
[0084]稱取無水NaAc49.22g,加去離子水定容到200mL,高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0085](10) 5mol/L LiCl 溶液
[0086]稱取無水LiC142.4g，加去離子水定容到200mL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0087](11) 10mg/mL 溶菌酶
[0088]使用前，稱取IOmg的溶菌酶，加lOmmol/L的Tris-Cl (PH8.0)即刻溶解定容至ImL，-20°C保存。
[0089]三、大量制備質(zhì)粒
[0090]1.挑取步驟(一)和(二)中制備的已保存于-20°C的含有目的質(zhì)粒(pVAX I，PVAX-HSP60)的陽性菌液于Kan+LB固體選擇培養(yǎng)基上劃線，37°C培養(yǎng)過夜。挑取板上的一個單菌落置于12mL Kan+LB液體選擇培養(yǎng)基中，搖床37°C，以180~220轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12~16h。將上述培養(yǎng)菌液以體積比1:100的比例接種到裝有400mL Kan+LB液體選擇培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶中，搖床37°C，在180~220轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)過夜。
[0091]2.將步驟I得到的細(xì)菌培養(yǎng)物置于冰中或4°C冰箱數(shù)分鐘，4°C，以9000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心5min，收集細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀，棄上清(利用移液器小心吸出上清)，倒置離心管使上清盡量流出。用10mL4°C預(yù)冷的Solution I重懸菌體，旋渦振蕩，使細(xì)菌在Solution I中完全分散。(由于旋渦振蕩和Solution I的加入已足夠是菌液裂解分散，為了簡化操作，此處省去現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)一步裂解分散的步驟:加入ImL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0),震蕩混勻)。
[0092]3.在步驟2得到的菌液中加入20mL新配制的Solution II，輕搖并上下顛倒混勻2~4次。再加入15mL4°C預(yù)冷的Solution III，立即輕搖混勻，以免產(chǎn)生局部沉淀。冰上或-20°C冰箱放置IOmin0加Solution II和Solution III的時間間隔控制在5min以內(nèi)，以免過分裂解。4°C或室溫，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，利用4層紗布將上清過濾，轉(zhuǎn)移到兩個新50mL離心管中。
[0093]4.將步驟3得到的上清與14_16mL異丙醇(現(xiàn)有技術(shù)中此處需加入0.6倍體積的異丙醇的方法，本 申請人:通過實驗發(fā)現(xiàn)，異丙醇的加入量在0.6倍體積上下各Iml的范圍內(nèi)，是不影響產(chǎn)物的提取質(zhì)量和產(chǎn)量的)混勻，室溫放置lOmin。室溫下，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，棄上清，將空管倒置于濾紙上數(shù)分鐘，除去殘余。加入3mL ddH20充分溶解，再加入3mL預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液(此時需先加ddH20，后加LiCl，才能使沉淀充分溶解，顛倒步驟易造成沉淀溶解不充分或不溶解)，充分混勻，此處不可用吹打的方式混勻。吹打混勻易使提取的質(zhì)粒發(fā)生斷裂，兩只離心管合并為一管，冰中或_20°C冰箱放置lOmin。4°C或室溫，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，將上清分別轉(zhuǎn)移到一新50mL離心管中，加入等體積(12mL)預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin。4°C或室溫，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心lOmin，小心棄上清，倒置控干管內(nèi)液體，一般倒置10~15min即可。此時管壁會出現(xiàn)白色沉淀物即質(zhì)粒。
[0094]5.在步驟4制備的白色沉淀物中加入3mL ddH20或TE溶液(pH8.0)溶解沉淀，并加入30 μ L10mg/mL RNase A (Takara公司產(chǎn)品)，37°C水浴Ih除去RNA。加入2倍體積(8mL)無水乙醇和1/10體積(400 μ L)。用3mol/L NaAc溶液，充分混勻，冰中或_20°C冰箱放置20min。4°C，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，小心將上清吸出(勿用傾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出)，并將離心管倒置于濾紙上控干(主要控干殘余的試劑如:乙醇和NaAc，減少雜質(zhì)，提高質(zhì)粒的純度)。加入IOOyL ddH20或TE溶液(PH8.0)，充分洗脫質(zhì)粒沉淀。利用分光光度計測量所得質(zhì)粒的濃度并記錄，測出的濃度為10000mg/mL。因此，我們將以保存濃度為1000mg/mL (十倍稀釋)的量分裝于1.5mL離心管中，即每管保存有1000mg質(zhì)粒,體積為ImL,分裝封口后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0095]四、質(zhì)粒DNA的純度檢測
[0096]以ddH20或TE (ρΗ8.0)為空白對照，用分光光度計測定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。雙鏈DNA純品的OD26tZOD28tl值為1.8，若樣品0D26(l/0D28(l值低于
1.8，說明樣品可能被蛋白質(zhì)污染，需進(jìn)一步純化。
[0097]五、重組質(zhì)粒的免疫效果評價
[0098]1.KM鼠免疫與分組:為了降低應(yīng)激反應(yīng)，KM鼠買回后需飼養(yǎng)I周，然后將其隨機分為4個組，每組35只，具體分組見表1。
[0099]表1免疫實驗分組情況
[0100]
【權(quán)利要求】
1.一種用于弓形蟲感染預(yù)防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列: 1)序列表中SEQID N0.1中所示的核苷酸序列； 2)與I)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列； 3)對上述I)或2)所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預(yù)防功能的核苷酸序列。
2.一種重組蛋白，其氨基酸序列由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于:所述重組蛋白的氨基酸序列參見序列表中 SEQ ID N0.2。
4.一種重組載體，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
5.一種重組質(zhì)粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
6.一種疫苗，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列、權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白、權(quán)利要求4所述的重組載體、權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒、權(quán)利要求6所述的疫苗在弓形蟲感染預(yù)防中的應(yīng)用。
8.—種權(quán)利要求6所述的疫苗的制備方法，步驟如下: (1)提取弓形蟲RH株總RNA;
(2)RT-PCR 擴(kuò)增 RH 株總 RNA ； (3)將步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接； (4)pVAXI質(zhì)粒的小量提取； (5)回收pVAXI載體及目的片段HSP60 ； (6)連接pVAXI載體與目的片段HSP60 ; (7)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時所用引物為: 上游引物:5' -GGTACCATGCTTGCCCGCGCTTCAGC -3'； 下游引物:5' -AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAGTACATGCCTCCCATGCCGC-3'。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min，94°C變性Imin, 60.4°C復(fù)性45s ;72°C延伸2min ；35個循環(huán)，最后，72°C延伸IOmin。
【文檔編號】C12R1/90GK103966238SQ201410135774
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】周東輝, 路靜, 陳佳, 黃思揚, 宋慧群, 徐民俊, 朱興全 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所