一株食品級黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株從醬醅中分離的能夠防治玉米赤霉烯酮毒素的食品級黑曲霉（Aspergillus?niger）菌株FS-Z1，保藏編號CCTCC?NO：M?2013703。該菌株對玉米赤霉烯酮具有良好的降解效果，降解率達到89.56%。并且通過大鼠動物實驗驗證了黑曲霉發酵液降解后的玉米漿中玉米赤霉烯酮的毒性消失。
【專利說明】—株食品級黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株黑曲霉，特別是從醬醅中篩選分離出的能夠防治玉米赤霉烯酮毒素的食品級菌株。
【背景技術】
[0002]玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是由鐮刀菌產生的一種類雌激素樣真菌毒素，是世界上污染最為廣泛的一種鐮刀菌毒素，全世界谷物和飼料普遍受到玉米赤霉烯酮的嚴重污染。在中國，不良的谷物收獲條件和油料加工過程加重了 ZEA的污染，低質量的玉米和糧食加工副產品，特別是非常規原料的廣泛使用，使ZEA等霉菌毒素的污染程度遠遠超出國外。ZEA及其代謝物的主要毒性歸因于它們的動情激素活性和合成代謝活性。大量研究證實，ZEA及其代謝物能夠引起很多動物的真菌毒素中毒癥，影響內臟器官發育，還可導致動物繁殖障礙、消化系統功能紊亂，給畜牧業帶來很大的經濟損失。
[0003]目前，針對去除飼料和食品中玉米赤霉烯酮的方法，根據其作用原理可分化學法，物理法和生物法三類。其中物理脫毒法在去除玉米赤霉烯酮毒素的同時也會造成動物飼料營養物質的流失；而化學脫毒法雖然可以脫去一些霉變較嚴重的谷物飼料，但費時費工，而且對營養成分造成極大的破壞，還可能產生一些對動物健康有害的化學物質，值得注意的是，歐盟不允許在食品生產過程中應用化學方法消除真菌毒素。由于傳統的物理、化學方法去除毒素污染存在著不可避免的局限性，利用生物降解法清除ZEN毒素已成為重要的研究方向，生物降解是指霉菌毒素分子的毒性基團被微生物產生的次級代謝產物或者所分泌的胞內、胞外酶分解破壞，同時產生無毒的降解產物過程。這種脫毒的方法不會破壞原料當中的其他成分，不會降低營養價值。因此，生物降解法是去除ZEN最有效及可行的方法。
[0004]研究表明多種微生物對玉米赤霉烯酮具有生物防治作用。如枯草芽胞桿菌，不動桿菌屬，惡臭假單胞菌，藤黃微球菌，毛孢子菌屬，膠紅類酵母菌等微生物對玉米赤霉烯酮有較強的脫毒作用；Kakeya H等對分離到粉紅粘帚霉(C.rosea IF07063)菌株進行了研究，研究發現該菌株可將ZEN轉化為1-(3，5 二羥苯基)-10'-羥基-1'反式十一碳烯-6'-酮，該降解產物無任何雌激素活性。余元善成功的從農業土壤中分離到一株能以ZEN為唯一碳源和能源生長的不動桿菌屬SM04，該菌株的上清發酵液具有高效降解ZEN的能力。因此分離出一種對玉米赤霉烯酮毒素具有良好防治及降解效果的安全菌株具有十分重要的意義。

【發明內容】

[0005]本發明提供了一株食品級黑曲霉FS-Zl (Aspergillus niger)FS-Z1菌株，已于2013年12月24日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC M2013703;以其ISSrDNA全序列為基礎的系統發育樹如說明書附圖1所示。該菌株對玉米赤霉烯酮具有良好的降解效果，降解率達到89.56%。
[0006] 所述黑曲霉是從醬醅中分離得到，其保藏條件如下:從生長良好的固態平板培養基上接取3環黑曲霉孢子到搖瓶培養基中，28°C搖床(150rpm)培養36h，取0.65mL移入含有0.3mL無菌甘油的甘油管中，放入_70°C超低溫冰箱保存。
[0007]所述固體平板培養基PDA為(w/v):馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1L，自然pH, 121 °C高壓滅菌15min。
[0008]所述液體培養基PDB為(w/v):馬鈴薯300g、葡萄糖20g、蒸餾水1L、自然pH、121°C高壓滅菌15min。
[0009]所述黑曲霉的培養條件為:將已保藏甘油管的黑曲霉接入固體培養基活化3d，然后再接入到液體培養基，280C，150rpm,搖床培養。
[0010]所述黑曲霉的篩選條件為:將從醬醅篩選出來的黑曲霉接種到PDA固體培養基中，28°C培養36h，取50ml生理鹽水洗下孢子，振蕩均勻，形成單孢子懸浮液，制成IO8CFU/ml的菌懸液。按2%的接種量接種到60ml無菌PDB培養基中，28°C，150rpm，搖床培養5d，向發酵液中加入玉米赤霉烯酮，使其終濃度達到2ppm，以無菌PDB培養液加玉米赤霉烯酮作為空白對照，分別于48h后用HPLC檢測法檢測玉米赤霉烯酮的濃度。
[0011]本發明還提供了一種所述黑曲霉在降解玉米赤霉烯酮中的應用方法，最適降解條件為菌液接種量2%，降解溫度28°C，降解pH=5，轉速150r/min，降解時間48h。
[0012]所述的黑曲霉在食品、飼料領域的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0013]本發明是從醬醅中分離得到的對玉米赤霉烯酮具有良好降解效果的安全菌株，對玉米赤霉烯酮的降解 效率達到89.56%，該菌株還可應用食品，農產品，糧食以及飼料等領域中多種真菌毒素的降解中，達到降低真菌毒素尤其是玉米赤霉烯酮含量的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:食品級黑曲霉FS-Zl (sample)的系統發育樹
[0015]圖2:食品級黑曲霉FS-Zl對玉米衆中玉米赤霉稀麗的降解效果
[0016]圖3:大鼠動物實驗驗證玉米赤霉烯酮被降解后的毒性(1-肝；2_腎)
[0017]A:生理鹽水組；B:玉米漿組；C:降解組。D:培養液組；
【具體實施方式】
[0018]實施例1:醬醅中黑曲霉的篩選方法
[0019]從發酵4d后的醬中用含β -環糊精的PDA培養基定性地分離出醬醅中的非產毒絲狀真菌，然后用ELISA方法對所分離菌株的產毒能力進行定量分析，最后篩選出非產毒的霉菌。對能抑制黃曲霉產毒菌進行復篩，篩選出能防治真菌毒素的菌株。
[0020]通過菌落特征觀察和個體形態觀察，并將菌株的18S rDNA與GenBank數據庫(http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已知序歹Ij 對 I:匕，發現其與黑曲霉(Aspergillus niger)同源性達100%。結合菌株的形態特征和分子生物學鑒定,可確定菌株為黑曲霉。本菌株與2013年12月24日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCCM2013703，保藏地址為中國武漢大學。
[0021 ] 實施例2:黑曲霉對玉米赤霉烯酮的降解
[0022]將分離得到的菌株FS-ZI按2%的接種量接種到60ml無菌PDB培養基中，280C 150rpm,搖床培養5d。向發酵液中加入玉米赤霉烯酮使其終濃度達到2ppm,以無菌PDB培養液加玉米赤霉烯酮作為空白對照，分別培養48h后，從兩組樣品中吸取2ml液體加A4ml三氯甲烷，萃取3次，氮氣吹干后再加Iml流動相[乙腈:水=50:50 (v/v)]復溶，過
0.22 um的有機濾膜后用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測。
[0023]色譜檢測條件為:色譜柱:C18柱6mmX 150mmX5um ;流動相:乙腈:水=50:50 ；檢測溫度:25°C ;流速:lml/min ;檢測波長:激發波長:274nm ;發射波長:440nm ;進樣量:20 μ L ;洗脫時間20min ;玉米赤霉烯酮的保留時間在6.5±0.5min。
[0024]結果顯示,玉米赤霉烯酮的降解率達到89.56%ο
[0025]實施例3:黑曲霉FS-Zl對玉米赤霉烯酮毒素污染的玉米漿的防治
[0026]將分離得到的菌株FS-ZI按2%的接種量接種到60ml無菌PDB培養基中，280C 150rpm，搖床培養5d。用四層無菌紗布將黑曲霉的菌絲過濾，得到黑曲霉的發酵液。將發酵液與玉米漿混合[l:l(v/v)]振蕩均勻，以無菌PDB培養基與玉米漿等體積混合作為空白對照，于28°C 150rpm的條件下培養48h，經玻璃纖維濾紙過濾I~2次，至濾液澄清，按上述方法提取樣品中的玉米赤霉烯酮，用高效液相色譜法檢測殘留玉米赤霉烯酮毒素的含量。
[0027]經高效液相色譜法測定，發現Oh玉米漿中玉米赤霉烯酮的濃度為29.06ppm,而48h過后玉米漿中毒素的 含量僅為11.62ppm,降解率達60% (圖2)。
[0028]實施例4:大鼠動物實驗驗證玉米赤霉烯酮被降解后毒性變化
[0029]大鼠灌胃前禁食12h，自由飲水，稱體質量并記錄，做好標記，隨機分成4組，即:灌胃生理鹽水組(簡稱:生理鹽水組A);灌胃被玉米赤霉烯酮污染的玉米漿組(簡稱:玉米漿組B);灌胃污染玉米漿和黑曲霉發酵液共培養48h實驗組(簡稱:降解組C);灌胃無菌TOB培養液組(簡稱:培養液組D);，每組各8只。各組小鼠每日同一時間灌胃處理，自由采食飲水，持續30天，最后脫頸處死。取出大鼠的肝臟和腎臟，經過石蠟包埋，切片，HE染色，在100X和400X的光學顯微鏡下觀察其組織切片圖。結果發現，玉米漿組B由于玉米赤霉烯酮毒素含量高，導致大鼠的肝腎明顯損壞:肝細胞脂肪變性、局灶性壞死；腎小球發生明顯萎縮，腎細胞脂肪變性；而降解組C的大鼠肝腎和對照組A，對照組D均未發現明顯的組織損壞，這說明黑曲霉發酵液能夠降解玉米漿中的玉米赤霉烯酮毒素，并使其毒性消失。因此，該黑曲霉對玉米赤霉烯酮的降解是安全無毒副產物的菌株，為動物飼料提供了一種高效安全的脫毒方法。
[0030]可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一株食品級黑曲霉FS-Zl (Aspergillus niger)FS-Z1菌株，于2013年12月24日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為:CCTCC M2013703，保藏地址為中國武漢武漢大學。
2.根據權利要求1所述黑曲霉，其特征在于該菌株是從醬醅中經過初篩復篩分離出的能夠防治黃曲霉毒素B1、玉米赤霉稀麗的囷株。
3.權利要求2中所述的黑曲霉，其特征在于該菌株對玉米赤霉烯酮的降解率可達到89.56%。
4.根據權利要求1-3任一所述黑曲霉在降解玉米赤霉烯酮中的應用。
5.權利要求4中所述的方法，其特征在于該菌株對玉米赤霉烯酮的最適降解條件為菌液接種量2%，降解溫度28°C，降解pH=5，轉速150r/min，降解時間48h。
6.根據權利要求1-3任一所述的黑曲霉在食品、飼料領域的應用。
【文檔編號】C12N1/14GK103937681SQ201410147140
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優先權日:2014年4月11日
【發明者】孫秀蘭, 何興興, 徐丹, 張銀志 申請人:江南大學