專利名稱：基于多重放大系統的檢測玉米赤霉烯酮的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物檢測工程技術領域的方法，具體是一種快速檢測谷物類、谷物類相關產品、飼料中玉米赤霉烯酮的方法。
背景技術：
玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone, ZEN)是鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產生的次級代謝產物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥等谷物， 也可存在于食用含ZEN飼料的動物組織中，包括牛奶、雞蛋等。玉米赤霉烯酮毒素與自發性乳腺癌，輸卵管和子宮水腫、增生，精細胞畸變、凋亡等疾病有關。玉米赤霉烯酮毒素具有分布廣泛、殘留時間長、難處理、和其他毒素一起有增強毒性的現象。加入WTO之后，農產品及相關食品的國際貿易量日益增加，隨之對進出口產品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關、生產企業、監督部門等部門迫切需要一種快速簡便的玉米赤霉烯酮毒素檢測方法。化學發光(Chemiluminescence, CL)早在19世紀80年代就得到證實，即在化學反應過程中瞬間以釋放光子的形式放出能量。后發展出放射免疫分析技(Radioimmunoassay, RIA)，因其高靈敏度和高特異性而受到普遍應用。CLIA是在RIA基本理論的基礎上，以標記發光劑為示蹤物信號建立起來的一種非放射標記免疫分析法。近年來發展迅猛，是目前發展和推廣應用最快的免疫分析方法，也是目前最先進的標記免疫測定技術，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數量級，顯著優于放射免疫分析和酶聯免疫分析。化學發光酶免疫分析(ChemiluminescentEnzyme Immunoassay, CLEIA)屬酶免疫分析，只是酶反應的底物是發光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定。在酶促化學發光免疫分析中可供標記的酶有很多，目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。免疫磁酶技術是將IgG標記在標記有Protein A的磁珠上，進行酶聯免疫方法的技術。其優勢是利用磁珠的富集作用，檢測較大體積溶液中的微量抗原。鏈霉親和素-生物素系統在方法中使用，是由于鏈霉親和素可以和4個生物素穩固結合，因此在信號放大方面被廣泛使用。關于玉米赤霉烯酮毒素檢測，國內外已建立了多種方法。目前檢測ZEN的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)，液譜和質譜聯用法(LC-MS) 和ELISA方法。然而，這些方法需要對檢測樣品進行嚴格的預處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時要求有專業的操作人員，不利于現場常規檢測使用。已有的檢測玉米赤霉烯酮毒素的ELISA試劑盒，在檢測靈敏度上不及本發明的超靈敏化學發光ELISA方法，因此本方法對保障谷物類食品的安全具有更重要的作用
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種基于多重放大系統的檢測玉米赤霉烯酮的方法，本發明檢測對象針對性強，準確率高，靈敏度較市售ELISA檢測試劑盒高。并且由于本發明采用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素無交叉反應，較市售的以多克隆抗體為基礎的ELISA試劑盒有更強的特異性，減少了假陽性率。本發明是通過以下技術方案實現的一種基于多重放大系統的檢測玉米赤霉烯酮的方法，該方法包括以下步驟步驟一，將ZEN半抗原與OVA偶聯，得到偶聯物ZEN-0VA，再與biotin偶聯，得到偶聯物 OVA-ZEN-biotin ；步驟二，將抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結合，得到抗體-磁珠結合物；步驟三，將所述抗體-磁珠結合物加入EP管中，用洗滌液洗滌，對待側樣品進行萃取，將待側樣品的萃取液稀釋后加入上述管中，震蕩；步驟四，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入所述OVA-ZEN-biotin，震蕩；步驟五，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入SA-HRP，震蕩；步驟六，去除上清液，用洗滌液洗滌，加入發光底物，震蕩，測定發光值；步驟七，根據已知不同濃度ZEN與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體加入后得到的發光值，制作標準曲線，再根據待測樣品的發光值，通過標準曲線得到樣品中的ZEN濃度。優選地，在所述步驟一中，所述ZEN半抗原與所述OVA的偶聯通過活潑酯法完成。優選地，在所述步驟一中，所述偶聯物ZEN-OVA與所述biotin的偶聯通過活潑酯法完成。優選地，在所述步驟三中，所述洗滌液為pH為7. 4的0. OlM磷酸鹽緩沖液。優選地，在所述步驟三中，所述萃取液的稀釋倍數為5倍。優選地，在所述步驟三中，所述萃取的方法為取樣品，按照重量體積比I : 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min，將上清液通過快速定性濾紙過濾，即得萃取液。進一步優選地，所述稀釋液為pH 8. 2的0. IM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液含有體積比為 0. 01% ^ Tween-20 O優選地，在所述步驟三中，所述震蕩步驟為室溫震蕩30分鐘。優選地，在所述步驟六中，所述震蕩步驟為室溫震蕩I分鐘。優選地，在所述步驟七中，所述標準曲線的做法為以加入ZEN濃度的對數值為橫坐標，以加入不同濃度ZEN所得到的不同發光值除以不加入ZEN所得到的發光值為縱坐標， 通過Microsoft Excel軟件,做出散點圖并添加趨勢線公式和R2 ；本發明具有如下的有益效果本發明是鑒于待測樣品若有ZEN毒素，由于ZEN和免疫磁珠上的抗ZEN單克隆抗體特異性結合，而卵清蛋白(OVA)與ZEN和生物素(biotin)的偶聯物OVA-ZEN-biotin加入反應體系中后，可以和未被ZEN結合的單克隆抗體結合。而且在加入鏈霉親和素(SA)偶聯的辣根過氧化物酶(HRP)后，HRP再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定。由于待測樣品中含有的ZEN的量與發光檢測結果有線性關系，因此可以通過標準曲線算出待測樣品中含有的ZEN的量。本發明檢測對象針對性強，準確率高，靈敏度較市售ELISA檢測試劑盒高。并且由于本發明采用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素無交叉反應，較市售的以多克隆抗體為基礎的ELISA試劑盒有更強的特異性，減少了假陽性率。


圖I為本發明實施例原理的示意圖；圖2為本發明實施例檢測的示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟一，玉米赤霉烯酮包被抗原(OVA-ZEN)的制備取O. 33ml (3mg/ml) ZEN,混合于I. 2ml卩比唳中，加入2mg O-羧甲基輕胺，室溫攪拌反應24h。真空干燥后，加入4ml蒸餾水，并使其溶解，調整pH至8. O。未反應的ZEN用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相調pH至3.0，用乙酸乙酯抽提 (IOml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，棄水相。酯相用無水硫酸鈉濾過后吹干。吹干后的結晶物溶于O. 5ml堿性氧化鋁處理過的二氧六環中。稱取IOmg OVA溶于O. 7ml O. 05mol/ L(pH7. 2)的PBS中，將兩溶液于4°C緩慢混合。Img N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)和2mg N、 N’-二環己碳二亞胺(DCC)溶于O. 2ml 二氧六環中，并緩慢滴加此溶液。將混合后的溶液放置室溫攪拌反應16h。調pH至6. 0，通風櫥中吹干，緩慢滴加DCC溶液(2mg DCC溶于O. 2ml 二氧六環中)。室溫攪拌反應48h。最后用PBS透析2 3d, _20°C保存。步驟二，OVA-ZEN-biotin的制備O. Img NHS-biotin 加入至含有 lmg/ml 0VA-ZEN 的 O. 01mol/L碳酸氫鈉緩沖液中， 攪拌混勻后，緩慢加入0. 2mg DCC溶液(溶于0. 2ml 二氧六環中)，將混合后的溶液放置室溫攪拌反應48h。最后用PBS透析2 3d，-20°C保存。步驟三，抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結合取免疫磁珠50μ 1，使用洗滌液(0. OlM磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4)洗滌3次后， 加入含5yg抗ZEN單克隆抗體的結合緩沖液(0. IM磷酸緩沖液，pH 8. 2，含0. 01 % Tween-20) 200 μ I,室溫震蕩反應30分鐘。再使用洗滌液洗滌3次，最后加入結合緩沖液，_4°C保存。步驟四，化學發光ELISA檢測待測樣品萃取液(I)將抗體-磁珠結合物稀釋至一定濃度后取50 μ I加入EP管中，使用洗滌液洗滌3次。取0. 3g樣品，加入3ml 70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min。上清液通過快速定性濾紙過濾，使用結合緩沖液(0. IM磷酸緩沖液，pH 8. 2，含0. 01% Tween-20) 稀釋5倍后，取Iml加入含有抗體-磁珠的管中，室溫震蕩反應30分鐘，其中在標準曲線孔中依次加入1、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01,0. 00U0ng/ml的ZEN純品1ml，并做3次重復；在待測孔中加制備的待測樣品萃取液lml，并做3次重復，空白孔中不加入抗體-磁珠結合物，如圖 2所示。
(2)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌3次后，將OVA-ZEN-biotin使用結合緩沖液稀釋至一定濃度后，取200 μ I加入EP管中，室溫震蕩反應30分鐘。(3)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌3次后，將SA-HRP使用結合緩沖液稀釋至一定濃度后，取200 μ I加入EP管中，室溫震蕩反應30分鐘。(4)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌后加入發光底物(魯米諾+對碘酚)200 μ 1，室溫震蕩反應I分鐘后吸出，加入96孔板中，用發光信號測定儀進行發光測定，得到結果。如圖I所示,磁珠I與Protein A 2結合,抗ZEN單克隆抗體3分別與Protein A 2 和 SA-HRP 5 結合，OVA-ZEN-biotin 4 與 SA-HRP 5 結合。步驟五，檢測ZEN的標準曲線的制作與結果判定(I)根據已知不同濃度ZEN與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體加入后，得到的發光值，繪制標準曲線，具體做法為以加入ZEN濃度的對數值為橫坐標，以加入不同濃度ZEN 所得到的不同發光值的平均數，除以不加入ZEN(空白)所得到的發光值為縱坐標，通過 Microsoft Excel軟件,繪制散點圖并添加趨勢線公式和R2。(2)根據待測樣品的發光值的平均值，通過標準曲線所得到的趨勢線公式計算，得到對應的ZEN濃度。
權利要求
1.一種基于多重放大系統的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，將ZEN半抗原與OVA偶聯，得到偶聯物ZEN-0VA，再與biotin偶聯，得到偶聯物OVA-ZEN-biotin ；步驟二，將抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結合，得到抗體-磁珠結合物；步驟三，將所述抗體-磁珠結合物加入EP管中，用洗滌液洗滌，對待側樣品進行萃取， 將待側樣品的萃取液稀釋后加入上述管中，震蕩；步驟四，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入所述OVA-ZEN-biotin，震蕩；步驟五，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入SA-HRP，震蕩；步驟六，去除上清液，用洗滌液洗滌，加入發光底物，震蕩，測定發光值；步驟七，根據已知不同濃度ZEN與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體加入后得到的發光值， 制作標準曲線，再根據待測樣品的發光值，通過標準曲線得到樣品中的ZEN濃度。
2.如權利要求I所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述 ZEN半抗原與所述OVA的偶聯通過活潑酯法完成。
3.如權利要求I所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述偶聯物ZEN-OVA與所述biotin的偶聯通過活潑酯法完成。
4.如權利要求I所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述洗滌液為pH為7. 4的0. OlM磷酸鹽緩沖液。
5.如權利要求I所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述萃取液的稀釋倍數為5倍。
6.如權利要求I所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述萃取的方法為取樣品，按照重量體積比I : 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩 15min，靜置30min，將上清液通過快速定性濾紙過濾，即得萃取液。
7.如權利要求6所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，所述稀釋液為pH8.2 的0. IM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液含有體積比為0. 01%的Tween-20。
8.如權利要求I所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述震蕩步驟為室溫震蕩30分鐘。
9.如權利要求I所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟六中，所述震蕩步驟為室溫震蕩I分鐘。
10.如權利要求I至9任一項所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟七中，所述標準曲線的做法為以加入ZEN濃度的對數值為橫坐標，以加入不同濃度ZEN 所得到的不同發光值除以不加入ZEN所得到的發光值為縱坐標，通過MicrosoftExcel軟件，做出散點圖并添加趨勢線公式和R2。
全文摘要
本發明涉及一種基于多重放大系統的檢測玉米赤霉烯酮的方法，包括以下步驟將ZEN半抗原與OVA偶聯，得到偶聯物ZEN-OVA，再與biotin偶聯，得到偶聯物OVA-ZEN-biotin；將抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結合；將抗體-磁珠結合物加入EP管中，洗滌，將待側樣品的萃取液加入上述EP管中，震蕩，去除上清液，洗滌，再加入OVA-ZEN-biotin，震蕩，去除上清液，洗滌，再加入SA-HRP，震蕩，去除上清液，洗滌，最后加入發光底物，震蕩，測定發光值；制作標準曲線，再根據待測樣品的發光值，通過標準曲線得到對應的ZEN濃度。本發明采用抗ZEN單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素無交叉反應，特異性強，減少了假陽性率。
文檔編號G01N33/64GK102608324SQ20121000234
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者嚴亞賢, 孫建和, 王元凱 申請人:上海交通大學