一種具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程和遺傳工程領域，公開了一種具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶突變體，其是在去除了自身信號肽的亮白曲霉和米曲霉的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的基礎上，通過單位點的定點飽和突變所獲得的，該突變體的轉糖苷活性比野生型提高15%以上。同時，本發明還公開了編碼上述突變體的DNA分子、含有上述DNA分子的重組表達載體以及表達上述DNA分子的宿主細胞。此外，本發明還提供了采用上述重組表達載體制備具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶的方法以及上述突變體、DNA分子、重組表達載體和宿主細胞在制備β-半乳糖苷酶中的應用。
【專利說明】一種具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體涉及一種具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]低聚半乳糖(GOS)是一類在人體胃腸道內不能被消化吸收而直接進入大腸被各種雙歧桿菌良好利用的具有特殊生物學功能的低聚糖。它能夠改善人體內微生態環境，有利于雙歧桿菌和其它有益菌的增殖，提高人體免疫功能。同時，GOS經代謝產生有機酸使腸內PH值降低，抑制腸內沙門氏菌和腐敗菌的生長，減少有毒發酵產物及有害細菌酶的產生，調節胃腸功能，減輕了肝臟分解毒素的負擔。由于低聚半乳糖有著比其他功能性低聚糖更優良的性質，從而使低聚半乳糖作為添加劑大規模應用更方便易行，能夠適應更多的食品種類和更廣的消費群體，有巨大的應用價值和市場潛力。
[0003]GOS制備方法通常有五種:從天然原料中提取、天然多糖的酸水解、化學法合成、發酵法及酶法合成。由于GOS在自然界中含量低，無色不帶電荷故難以提取分離；天然多糖轉化產品得率低，產物成分復雜，難以純化；化學法毒性大易殘留，對環境污染重；發酵法生產GOS的研究很少，仍處于實驗室規模，無法進行大量生產。目前低聚半乳糖的工業化生產是通過β -半乳糖苷酶完成的。β -半乳糖苷酶(β-D-galactoside galatohydrolase,EC3.2.1.23)又稱乳糖酶(Lactase)，具有水解和轉糖苷的雙重作用。早先對于β -半乳糖苷酶的研究主要集中在利用其水解功能生產低乳糖乳制品，來解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹瀉、腹脹等多種不良反應。隨著低聚半乳糖特殊的保健功能的確定，利用β-半乳糖苷酶的轉糖苷作用生產低聚半乳糖成為研究熱點。主要集中在以下三個方面:
[0004]1、篩選高轉糖苷活性的β -半乳糖苷酶產生菌
[0005]酵母、芽孢桿菌、曲霉、青霉、雙歧桿菌等多種微生物中都有具轉糖苷酶活性的 半乳糖苷酶。研究表明，不同來源的半乳糖苷酶因其酶學性質各異，合成低聚半乳
糖時的反應條件大不相同。β_半乳糖苷酶根據最適PH可分為酸性和中性兩種。通常霉菌來源的半乳糖苷酶為酸性酶，其作用最適pH在ρΗ2.5~5.5，最適反應溫度較高(50~600C );酵母和細菌所產的β -半乳糖苷酶為中性酶，其最適pH介于ρΗ6~7.5,最適反應溫度較低(30~40°C )。不同來源的β -半乳糖苷酶作用的底物類型也不盡相同，由此生成的低聚半乳糖中寡糖的種類和比例也千差萬別，這就使低聚半乳糖家族的新成員層出不窮。盡管如此，篩選到的天然β_半乳糖苷酶的轉糖苷活性普遍較低，低聚半乳糖的最高產率通常只有5~30%，無法滿足工業化生產的要求。
[0006]2、優化反應條件、改進生產工藝
[0007]有學者試圖通過優化低聚半乳糖的生產條件和工藝來彌補其轉糖苷活性低的缺陷，提高低聚半乳糖的得率，已取得了一定的效果。主要的方法有:增加起始乳糖的濃度、用有機溶劑控制水活度以及采用固定化技術。由于β_半乳糖苷酶的水解和轉糖苷反應是可逆的。當底物濃度較低時，水解產物半乳糖濃度較低，其對水解反應的抑制作用較小，此時酶表現出水解活力較高，而轉糖苷活力較低，因此產物中單糖含量較高。當乳糖濃度較高時，水解產物半乳糖濃度較高，當其達到一定值就對水解酶活產生抑制作用。半乳糖是轉糖苷的底物，濃度高有利于半乳糖寡糖的合成，因此底物濃度較高時，產物中寡糖含量較高。使用有機溶劑有利于低聚糖的合成是因為有機溶劑能降低反應體系中水的活度以影響酶的活性位點和反應機制，引導水解酶催化逆向的轉半乳糖苷反應，使反應平衡由水解偏移向低聚糖合成。利用固定化技術則可大大增加游離酶的PH和熱穩定性并可反復利用，降低生產成本。Mozaffar將β _半乳糖苷酶吸附于酚醛樹脂并用戊二醛交聯后，低聚糖的產率提高了 20%;但也有研究發現，固定化酶作用于較高濃度的乳糖溶液時，產生的低聚糖比用游離酶還少。由此可見單純依靠優化條件始終無法從根本上解決問題。
[0008]3、利用基因工程手段提高β -半乳糖苷酶的表達和性質改良
[0009]自然界中野生的半乳糖苷酶GOS產量一般都維持在20~45%之間，產量較低，難以滿足生產需求，因此通過分子改造篩選轉糖苷性質優良的突變酶成為研究熱點。Hansen 0.(2001)等發現來源于雙歧桿菌中的β _半乳糖苷酶BIF3，缺失掉C末端580個氨基酸后將酶蛋白變為一個高效的轉糖苷酶，能夠利用幾乎90%乳糖生成G0S，而水解成分占10%，而且在10%至40%的乳糖濃度下始終能夠保持9:1比率的轉糖苷活力和水解活力；Placier G.于2009年對來源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌KVE39的β -半乳糖苷酶進行定向進化，將轉糖苷活力提高則水解活力降低作為篩選依據，成功篩選到三株突變體R109W，R109V，R109K，在18% (w/v)乳糖中低聚糖產量分別為23%，11.5%，21%，而野生酶只有2% ；ffuY.(2013)等對硫化葉菌來源的β -半乳糖苷酶進行分子改造,研究其最適GOS生成條件，在各自最適條件下突變體F441Y GOS產量為61.7%，F359Q為58.3%，而野生酶為50.9%。
[0010]然而，到目前為止，無論是天然酶的篩選分離、工藝優化還是通過基因工程手段提高β-半乳糖苷酶的表達和性質改良，都沒有改變β-半乳糖苷酶轉糖苷活性低和產量低的現狀，從而也就造成低聚半乳糖合成產率低，生產成本太高，這嚴重制約了低聚半乳糖的廉價生產和推廣應用。
[0011]因此，創制高轉糖苷活性的新型β-半乳糖苷酶，并使其廉價生產是目前研究和生產中亟需解決的主要問題之一。

【發明內容】

[0012]針對現有技術中存在的上述缺陷，本發明一方面提供了一種具有高轉糖苷活性的β -半乳糖苷酶突變體，其是在亮白曲霉或米曲霉β -半乳糖苷酶的基礎上，通過單位點的定點飽和突變而獲得的，優選是在序列2或序列4所示的氨基酸序列的基礎上，通過單位點的定點飽和突變所獲得的，所述突變體的轉糖苷活性比野生型提高15%以上，優選提高20%以上，更加優選提高30%以上。
[0013]在本發明優選的實施方案中，突變位點分別`為第219位、第245位或者第785位氨基酸。
[0014]在本發明進一步優選的實施方案中，單位點的定點飽和突變分別為用甘氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219G)、用谷氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219E)、用苯丙氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219F)、用纈氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219V)、用丙氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219A)、用精氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245R)、用賴氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245K)、用甘氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245G)、用絲氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245S)或用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基(E785V)。
[0015]本發明的另一方面提供了編碼上述突變體的DNA分子。
[0016]本發明的再一方面提供了含有上述DNA分子的重組表達載體，優選為重組酵母表達載體。
[0017]本發明的再一方面提供了表達上述DNA分子的宿主細胞，優選糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬和甲基營養型酵母菌株，甲基營養型酵母菌株更加優選為畢赤氏酵母屬菌株。
[0018]本發明的再一方面提供了一種制備具有高轉糖苷活性的β -半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟:
[0019]1、用上述的重組表達載體轉化宿主細胞，獲得重組菌株；
[0020]2、培養上述重組菌株，誘導重組β -半乳糖苷酶的表達；
[0021]3、回收并純化所表達的高轉糖苷活性的半乳糖苷酶。
[0022]本發明的最后一方面提供了本發明所述的突變體、DNA分子、重組表達載體以及宿主細胞在制備半乳糖苷酶中的應用。
[0023]本發明采用單位點的定點飽和突變技術對去除自身信號肽的亮白曲霉的β -半乳糖苷酶基因Iacb "和去除自身信號肽的米曲霉的β_半乳糖苷酶基因Iaco "進行了定點飽和突變，獲得了具有 高轉糖苷活性的半乳糖苷酶突變體，從而使其轉糖苷活性比野生型提高了 15%以上，甚至提高了 30%以上，使制備高轉糖苷活性的半乳糖苷酶成為現實，為β_半乳糖苷酶的應用奠定了良好的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:亮白曲霉和米曲霉的β -半乳糖苷酶與底物的分子對接過程。
[0025]圖2:亮白曲霉和米曲霉的β_半乳糖苷酶中突變位點與乳糖分子空間位置關系。
[0026]圖3:含突變體β -半乳糖苷酶基因的重組表達載體的構建過程。
[0027]圖4:S219位點典型突變體低聚半乳糖生成量。
[0028]圖5:F245位點突變體庫低聚半乳糖生成量趨勢。
[0029]圖6:F245位點典型突變體低聚半乳糖生成量。
[0030]圖7:E785位點突變體庫低聚半乳糖生成量趨勢。
【具體實施方式】
[0031]下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發明而非限定本發明。應當指出，對于本領域技術人員而言，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發明的保護范圍之內。
[0032]實施例1: β -半乳糖苷酶三級結構及突變位點的預測
[0033]去除自身信號肽的β -半乳糖苷酶基因Iacb ",為本實驗室從亮白曲霉(Aspergillus candidus)中克隆得到的，去除自身信號肽序列的基因由2958個核苷酸組成，具體序列如序列I所示，該基因編碼的蛋白質由986個氨基酸組成，具體序列如序列2所示。
[0034]去除自身信號肽的β -半乳糖苷酶基因Iaco ',為本實驗室從米曲霉(Aspergillus oryze)中克隆得到的，其也由2958個核苷酸組成，具體序列如序列3所示，該基因編碼的蛋白質也由986個氨基酸組成，具體序列如序列4所示。其氨基酸序列與lacb z基因編碼的蛋白質僅有三個氨基酸的差異:分別在第231位:lacb z (Gly),Iaco " (Ser);第 401 位:lacb " (Met), Iaco " (He);第 970 位:lacb " (Asp), Iaco "(Asn)0
[0035]以亮白曲霉和米曲霉的半乳糖苷酶為研究材料。以獲得晶體結構的青霉屬半乳糖苷酶(PDB登錄號:1TG7)，米曲霉β-半乳糖苷酶(PDB登錄號:4IUG)及里氏木霉半乳糖苷酶(PDB登錄號:30G2)的蛋白質晶體結構為同源模型，對半乳糖苷酶的3D結構及與底物結合的區域進行預測。預測的結構與文獻報道的預測結果高度相似(參見 The crystal structure of acidic β-galactosidase from Aspergillusoryzae,Mirko M.Maksimainenj International Journal of Biological MacromoIecuIes,2013，109-115)。酶蛋白由5個結構域組成:結構域I (I~394氨基酸)靠近N端，是該酶的活性中心所在，活性中心是TIM桶型結構；結構域2(395~573氨基酸)由16個反向平行的β-折疊片和I個α -螺旋組成，包含了一個類似免疫球蛋白的亞結構域；結構域3 (574~661氨基酸)由8個反向平行的β -折疊片組成一個“希臘鑰匙”的β -夾層和I個α -螺旋組成；結構域4(662~857氨基酸)和結構域5 (858~1005氨基酸)主要由“春卷”型的拓撲結構組成。對活性中心重點分析發現，位于TIM桶活性中心第4和第7條β -折疊片上的Glul60、Glu258可能是參與催化反應必不可少的氨基酸,而Asnl40和Tyr96可能用來固定乳糖分子。
[0036]根據得到的β -半乳糖苷酶的三維結構,通過Discovery Studio軟件進行酶與底物的分子對接模擬(參見附圖1)，根據對接結果解析，可獲知與底物存在相互作用的氨基酸(參見附圖2)。使用計算生物學軟件逐個評估這些氨基酸的進化熵，最終篩選確定了六個進化熵變化較大的氨基酸位點S219，D239，S240, Y241，F245和E785 (參見表1)用于定點飽和突變。
[0037]表1 β -半乳糖苷酶典型氨基酸的進化熵
[0038]
【權利要求】
1.一種具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶突變體，其是在亮白曲霉或米曲霉β-半乳糖苷酶的基礎上，通過單位點的定點飽和突變而獲得的，優選是在序列2或序列4所示的氨基酸序列的基礎上，通過單位點的定點飽和突變所獲得的，所述突變體的轉糖苷活性比野生型提高15%以上，優選提高20%以上，更加優選提高30%以上。
2.根據權利要求1所述的突變體，其中突變位點為第219位、第245位或者第785位氨基酸。
3.根據權利要求2所述的突變體，其中單位點的定點飽和突變分別為用甘氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219G)、用谷氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219E)、用苯丙氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219F)、用纈氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219V)、用丙氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(S219A)、用精氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245R)、用賴氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245K)、用甘氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245G)、用絲氨酸殘基取代第245位的苯丙氨酸殘基(F245S)或用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基(E785V)。
4.編碼權利要求1-3中任一項所述突變體的DNA分子。
5.含有權利要求4所述DNA分子的重組表達載體。
6.根據權利要求5所述的重組表達載體，其為重組酵母表達載體。
7.表達權利要求4所述DNA分子的宿主細胞。
8.根據權利要求7所述的宿主細胞，選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬和甲基營養型酵母菌株，其中甲基營養型酵母菌株優選為畢赤氏酵母屬菌株。
9.一種制備具有高轉糖苷活性的β_半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟: 1)用權利要求5所述的重組表達載體轉化宿主細胞，獲得重組菌株； 2)培養上述重組菌株，誘導重組β-半乳糖苷酶的表達； 3)回收并純化所表達的高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶。
10.權利要求1-3中任一項所述的突變體、權利要求4所述的DNA分子、權利要求5或6所述的重組表達載體、權利要求7或8所述的宿主細胞在制備β -半乳糖苷酶中的應用。
【文檔編號】C12N15/81GK103881994SQ201410148999
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】張偉, 張宇宏, 劉波, 孫寧, 張佳琳 申請人:中國農業科學院生物技術研究所