普通小麥麥谷蛋白亞基Bx13基因的分子鑒定方法及專用引物的制作方法
【專利摘要】本發明的公開了普通小麥麥谷蛋白亞基Bx13基因的分子鑒定方法及專用引物。本發明提供了鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bx13基因的引物，由由序列表序列1所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成。所述麥谷蛋白亞基Bx13基因來源于普通小麥Triticum aestivum L.。本發明的實驗證明，本發明提供了小麥品質性狀分子標記的通量實用檢測方法及專用引物，運用該專用引物對中國微核心種質中215份材料進行亞基Bx13基因檢測，結果表明該專用引物準確性高，重復性好，特異性強，方法簡單，無有毒試劑，分離迅速，分辨率高，檢測靈敏度高，可以為小麥品質育種的親本選擇和有利基因的發掘和利用提供可靠信息。
【專利說明】普通小麥麥谷蛋白亞基Bx13基因的分子鑒定方法及專用 引物

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，尤其涉及普通小麥麥谷蛋白亞基BX13基因的分子鑒 定方法及專用引物。

【背景技術】
[0002] 小麥麥谷蛋白的含量決定了小麥的面團強度和面筋彈性，影響著小麥的加工品質 (Figueroa et al. 2009)。研究表明，高分子量麥谷蛋白的含量在面包流變學特性方面的影 響比醇溶蛋白和低分子量麥谷蛋白更為明顯。小麥高低分子量麥谷蛋白亞基通過雙硫鍵 形成麥谷蛋白，其含量與小麥品質密切相關，高分子量麥谷蛋白亞基占小麥胚乳蛋白含量 的12%，含有豐富的谷氨酰胺重復序列，大量的氫鍵對小麥良好的烘焙品質有著決定性影響 (Shewry et al. 1989)，直接決定面包綜合品質，其等位變異可以解釋歐洲小麥品種在面包 烘倍品質方面變化的 45%_70%(Branlard and Dardevet 1985;Payne et al. 1988)。
[0003] 由于高分子量麥谷蛋白在小麥加工品質方面的卓越貢獻，其優質的亞基被廣泛 研究應用（Forde et al. 1985; Sugiyama et al. 1985; Thompson et al. 1985; Halford et al.1987;Anderson and Greenel989;Reddy and Appelsl993;De Bustos et al. 2001)〇 研究表明，高分子量麥谷蛋白亞基與小麥烘焙品質關系密切（Payne et al.l979Mengand Cai2008;Pang et al. 2009)。在Glu-1位點上，亞基對小麥加工品質具有上位效應（Rousset et al. 1992;Luo et al. 2001;Zhang et al. 2009)〇
[0004] 在位點內部，Bxl3亞基在Zeleny沉降值、面筋強度（Branlard等，2001)和面包綜 合品質（Bronnke等，2000)中表現優異。特別是延展性方面，Bxl3亞基是Glu-Bl位點上貢 獻最高的一個亞基，與小麥烘烤品質密切相關。因此，研究普通小麥高分子量麥谷蛋白亞 基的組成和分布，特別是Glu-Bl位點上Bxl3亞基，對小麥品質育種有重要意義。
[0005] 在亞基鑒定檢測方面，SDS-PAGE鑒定法局限性大，如亞基遷移率不規則，產品多樣 性差等，因此PCR技術被廣泛應用到生命科學的各個領域。專用引物的設計是PCR技術的 關鍵環節，但是到目前為止，可用于檢測HMW-GS的專用引物有N、Bxl7+Byl8、Bxl4+Byl5等， 有些麥谷蛋白的專用引物由于特異性弱、靈敏性低、重復性差、缺乏可靠的核苷酸序列等原 因，尚不具備或仍需改善。學者對Bxl3亞基的研究和統計基本是通過Bxl3+By 16亞基組合 開展，對Bxl3亞基進行單獨的專用引物設計和研究較少，因此進一步發掘并驗證Bxl3亞基 專用引物，尤其是更方便、靈敏、準確的Bxl3亞基專用引物意義重大。通過分析研究小麥優 質亞基的變異和亞基分布情況，有利于了解普通小麥種質資源的性狀，為小麥品質育種的 親本選擇和有利基因的發掘和利用提供相關信息。


【發明內容】

[0006] 本發明的一個目的是提供鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bxl3基因的引物。
[0007] 本發明提供的引物，由序列表序列1所不的單鏈DNA和序列表序列2所不的單鏈 DNA組成。
[0008] 上述引物中，所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源于普通小麥Triticum aestivum
[0009] 本發明的第二個目的是提供鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bxl3基因的PCR試劑。
[0010] 本發明提供的PCR試劑，包括上述的引物。
[0011] 上述PCR試劑由PCR擴增緩沖液、權利要求1或2所述的引物、dNTP、DNA聚合酶 和水組成；
[0012] 所述引物中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度為0. 2uM。
[0013] 上述PCR試劑中，所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源于普通小麥Triticum aestivum L 〇
[0014] 本發明的第三個目的是提供鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bxl3基因的試劑盒。
[0015] 本發明提供的試劑盒，包括上述的引物或上述的PCR試劑。
[0016] 上述試劑盒中，所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源于普通小麥Triticum aestivum
[0017] 上述的引物或上述的PCR試劑或上述的試劑盒在測鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞 基Bxl3基因中的應用也是本發明保護的范圍。
[0018] 上述應用中，所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源于普通小麥Triticum aestivum
[0019] 本發明的實驗證明，本發明提供了小麥品質性狀分子標記的通量實用檢測方法及 專用引物，運用該專用引物對中國微核心種質的材料進行亞基Bxl3基因檢測，結果表明該 專用引物準確性高，重復性好，特異性強，方法簡單，無有毒試劑，分離迅速，分辨率高，檢測 靈敏度商，可以為鑒定小麥是否含有Bxl3基因、小麥品質育種的未本選擇和有利基因的發 掘和利用提供可靠信息。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為部分小麥品種(系）Bxl3的檢測結果
[0021] 1是中優9507, 2是豐抗2號，3是長治6406,4是北京8號，M是分子Marker
[0022] 圖2為靈敏度檢測
[0023] 圖3為常規方法的靈敏度檢測

【具體實施方式】
[0024] 中優 9507 記載在如下文獻中：Molecular characterization and comparative transcriptional analysis of LMW-m-type genes from wheat(Triticum aestivum L. )and Aegilops species, Theoretical and Applied Genetics (2010), Volumel21, Issue5,pp845_856 ;公眾可從安徽農業大學獲得。
[0025] 豐抗 2 號記載在如下文獻中：Allelopathic Potential of Acacia confusa and Related Species in Taiwan, Journal of Chemical Ecology, Volume24, Issuel2，pp2131-2150 ;公眾可從安徽農業大學獲得。
[0026] 長治6406記載在如下文獻中：山西省農科院谷子研究所小麥品種改良及系譜分 析，山西農業科學（2011)，39 (3) :217-220 ;公眾可從安徽農業大學獲得。
[0027] 北京8號記載在如下文獻中：小麥骨干親本碧螞4號的基因組特異位點及其在衍 生后代中的傳遞，作物學報（2010)，36 (1) :9_16 ;公眾可從安徽農業大學獲得。
[0028] 烏江卓記載在如下文獻中：95個小麥農家品種的抗條銹性鑒定和SSR遺傳多樣性 分析，河北農業大學，2008,碩士論文；公眾可從安徽農業大學獲得。
[0029] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0030] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0031]實施例1、引物的設計和合成
[0032] 根據小麥高分子量麥谷蛋白亞基Bxl3基因設計并合成專用引物：
[0033]F: CGGGCACGAGACAATACG (序列 1)，
[0034] R:GCCGAGAAGTTGGGAAGTA (序列 2)。
[0035] 實施例2、引物在鑒定小麥高分子量麥谷蛋白亞基Bxl3基因中的應用
[0036] 一、引物鑒定小麥高分子量麥谷蛋白亞基Bxl3基因
[0037] 1、基因組DNA提取
[0038] 小麥品種烏江卓材料取3粒干種子，用單籽粒粉碎機磨碎1-3粒小麥干種子，放入 2ml離心管中，加900 iilSDS提取液，50-60°C水浴45-60min，期間間歇震蕩。在12000r/min 轉速下離心l〇min，吸取700 ii 1上清液，加入等體積（700 ii 1)酚-氯仿-異戊醇（25:24:1)， 于冰上顛倒混勻15min。在12000r/min轉速下離心lOmin，吸取500 y 1上清液，加入0. 6 倍異丙醇（300iil)和1/10倍體積（50iil)NaAc (pH5. 2)，混勻后冰上靜置15min，期間間 歇震蕩。管內出現絮狀DNA沉淀，在10000r/min轉速下離心lOmin，棄上清液，沉淀用70% 乙醇漂洗2遍，然后用無水乙醇漂洗1遍，室溫晾干，加100 ill的1XTE (或雙蒸水）溶解， 過夜，10倍稀釋，得到基因組DNA。
[0039] 2、PCR 擴增
[0040] 以上述1獲得的基因組DNA為模板，用實施例1合成的特異分子標記Bxl3的上游 引物和下游引物進行PCR擴增，反應體系和反應程序如下所示。
[0041] 10ul的PCR反應體系按照如下方法制備：2ul的基因組DNA(在反應體系中的終濃 度為20ng/ul)、特異分子標記Bxl3的上游引物和下游引物各0. 2ul (每條引物在反應體系 中的終濃度為〇. 2uM)、lul dNTP (在反應體系中的終濃度為0. 25mM)、taq酶(在反應體系中 的終濃度為 〇.〇65U/ul)、luLlx PCR butter，補加 ddH20 到 10uL。
[0042] PCR程序設定：循環前94°C預變性5min，94°C變性35S，62°C退火45S，72°C延伸 905,38個循環，最后721：延伸8111111。
[0043] 得到 1167bp 的 PCR 產物。
[0044] 將上述PCR產物與pUC-T simple載體連接、轉化，得到轉化子，提取轉化子的質 粒，送去測序，結果，該PCR產物具有序列表中序列3所示的核苷酸，與NCBI系統亞基Bxl3 基因序列（FM955452) BLAST比對得分最高(一致性達97%);說明本引物和方法正確，可以用 來鑒定Bxl3基因；且引物擴增條帶專一，無雜帶，比其它引物效果好。
[0045] 二、靈敏度檢測
[0046] 將20ng/ul小麥品種烏江卓的基因組DNA進行倍比稀釋作為模板：20ng/ul、2ng/ ul、0. 2ngAil、〇. 〇2ngAil、〇ngAil，按照上述一的方法用實施例1合成的特異分子標記Bxl3 的上游引物和下游引物進行PCR擴增，反應體系和反應程序按照上述一所示。
[0047] 結果如圖2所示，1為DNA模板在反應體系中的終濃度為20ng/ul、2為DNA模板在 反應體系中的終濃度為2ng/ul、3為DNA模板在反應體系中的終濃度為0. 2ng/ul、4為DNA 模板在反應體系中的終濃度為0. 02ng/ul、5為DNA模板在反應體系中的終濃度為Ong/ul， 從圖中可以看出，DNA模板稀釋1000倍則仍可以擴增出目的片段。
[0048] 按照文獻：Pang B, and Zhang X. Isolation and molecular characterization of high molecular weight glutenin subunit geneslBxl3andlByl6from hexaploid wheat. Journal of Integrative Plant Biology2008, 50 (3) ,329-337 中常規 Bxl3 基因引 物：F :ATGAGCTAAGCGCGCTGGTCCTCTTTG, R :CTATCACTGCCTGGTCCGACAATGCG，對 20ng/ul、2ng/ ul、0. 2ng/ul、0. 02ng/ul、0ng/ul的小麥品種烏江卓的基因組DNA進行擴增。
[0049] 結果如圖3所示，目標片段大小900bp，從圖中可以看出，DNA模板稀釋100倍則可 以擴增出目的片段，而稀釋1000倍則不能擴增出目的片段。
[0050] 因此說明，本發明引物的靈敏度高。
[0051] 因此，采用Bxl3的上游引物和下游引物可以用來檢測待測樣本是否含有Bxl3基 因，電泳檢測PCR擴增產物，若得到1160-1170bp的PCR產物，則待測樣本含有或候選含有 小麥高分子量麥谷蛋白亞基Bxl3基因；
[0052] 若未得到1160-1170bp的PCR產物，則待測樣本不含有或候選不含有小麥高分子 量麥谷蛋白亞基Bxl3基因。
[0053] 上述檢測Bxl3基因的PCR試劑由基因組DNA、終濃度均為0. 2uM的Bxl3的上游引 物和下游引物、終濃度為〇. 25mM的dNTP、終濃度為0. 065U/ul的taq酶、PCR緩沖溶液和水 組成。
[0054] 上述檢測Bxl3基因的試劑盒包括上述Bxl3的上游引物和下游引物或者包括檢測 Bxl3基因的PCR試劑。
[0055] 實施例3、檢測待測樣本
[0056] 按照實施例2的一的方法分別提取小麥中優9507、豐抗2號、長治6406、北京8號 基因組DNA，用實施例1合成的特異分子標記Bxl3的上游引物和下游引物進行PCR擴增，反 應體系和反應程序按照實施例2的一的所示。
[0057] 結果如圖1所示，小麥中優9507中得到1167bp的PCR產物，證明含有Bxl3基因， 將PCR產物送去測序，得確與NCBI系統亞基Bxl3基因序列（FM955452)同源性達到97%，說 明PCR產物為Bxl3基因，本發明的方法正確；
[0058] 豐抗2號中得到1161bp的PCR產物，證明含有Bxl3基因，將PCR產物送去測序， 得確與NCBI系統亞基Bxl3基因序列（FM955452)同源性達到97%，說明PCR產物為Bxl3基 因，本發明的方法正確；
[0059] 長治6406中得到1169bp的PCR產物，證明含有Bxl3基因，將PCR產物送去測序， 得確與NCBI系統亞基Bxl3基因序列（FM955452)同源性達到97%，說明PCR產物為Bxl3基 因，本發明的方法正確；
[0060] 北京8號中得到1165bp的PCR產物，證明含有Bxl3基因，將PCR產物送去測序， 得確與NCBI系統亞基Bxl3基因序列（FM955452)同源性達到97%，說明PCR產物為Bxl3基 因，本發明的方法正確。
【權利要求】
1. 鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bxl3基因的引物，由序列表序列1所不的單鏈DNA和 序列表序列2所示的單鏈DNA組成。
2. 根據權利要求1所述的引物，其特征在于：所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源于普通 小麥 Triticum aestivum L. 〇
3. 鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bxl3基因的PCR試劑，包括權利要求1或2所述的引 物。
4. 根據權利要求3所述的PCR試劑，其特征在于： 所述PCR試劑由PCR擴增緩沖液、權利要求1或2所述的引物、dNTP、DNA聚合酶和水 組成； 所述引物中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度為0. 2uM。
5. 根據權利要求3或4所述的PCR試劑，其特征在于： 所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源于普通小麥Triticum aestivum L.。
6. 鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bxl3基因的試劑盒，包括權利要求1或2所述的引物 或權利要求3-5中任一所述的PCR試劑。
7. 根據權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于：所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源 于普通小麥 Triticum aestivum L. 〇
8. 權利要求1或2所述的引物或權利要求3-5中任一所述的PCR試劑或權利要求6或 7所述的試劑盒在測鑒定或輔助鑒定麥谷蛋白亞基Bxl3基因中的應用。
9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述麥谷蛋白亞基Bxl3基因來源于普通 小麥 Triticum aestivum L. 〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104450875SQ201410149006
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】劉莉, 馬傳喜, 司紅起 申請人:安徽農業大學