一種基于離子交換的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于離子交換的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明利用弱堿陰離子交換樹(shù)脂對(duì)有機(jī)酸根的選擇性吸附的特點(diǎn)，將該種樹(shù)脂耦合進(jìn)乳酸菌的培養(yǎng)過(guò)程，徹底解除了乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中H+和酸根對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，使乳酸菌的生長(zhǎng)達(dá)到理想的無(wú)抑制狀態(tài)，且離子交換樹(shù)脂經(jīng)洗脫和處理后可重復(fù)利用。本發(fā)明方法適用于干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌的高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，樹(shù)脂經(jīng)解吸劑浸泡洗脫可得到高濃度、高純度的酸溶液，用于工業(yè)乳酸和乙酸的生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】—種基于罔子交換的乳酸菌局密度培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于離子交換的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌作為改善人體腸道菌群和人類身體健康的益生菌，越來(lái)越得到國(guó)際學(xué)術(shù)領(lǐng)域和大眾消費(fèi)者的認(rèn)可。乳酸菌發(fā)酵乳制品、含活菌飲料、益生復(fù)合菌劑、直投發(fā)酵劑等乳酸菌制品在市場(chǎng)上隨處可見(jiàn)，并深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。但是，乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，H+和酸根的積累是限制乳酸菌培養(yǎng)達(dá)到高密度的主要因素。
[0003]過(guò)去幾十年來(lái)國(guó)內(nèi)外眾 多學(xué)者圍繞提高乳酸菌的活菌量開(kāi)發(fā)了多種高密度培養(yǎng)方法，包括:優(yōu)化培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件，中和培養(yǎng)，透析培養(yǎng)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，膜過(guò)濾培養(yǎng)等。但是培養(yǎng)基無(wú)論進(jìn)行何種優(yōu)化，均解決不了乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中酸的積累，此法對(duì)提高乳酸菌的活菌量效果并不顯著；中和培養(yǎng)雖然通過(guò)添加堿液，消除了 H+的抑制，但是酸根的積累和鹽離子的引入，使培養(yǎng)液的滲透壓逐漸升高，限制了乳酸菌進(jìn)一步生長(zhǎng)；補(bǔ)料分批培養(yǎng)在補(bǔ)充養(yǎng)分的同時(shí)稀釋代謝產(chǎn)物濃度，降低其對(duì)乳酸菌的抑制作用，從而使乳酸菌進(jìn)一步生長(zhǎng)，但是伴隨著乳酸菌的進(jìn)一步生長(zhǎng)，有機(jī)酸依然不斷積累。連續(xù)培養(yǎng)雖然能夠不斷稀釋有害代謝產(chǎn)物的濃度，但是在排出基質(zhì)培養(yǎng)液的同時(shí)，乳酸菌亦被同時(shí)排出，活菌量始終無(wú)法達(dá)到理想的濃度，且造成原料和活菌的大量浪費(fèi)。上述這些方法均不能通過(guò)徹底解決礦和有機(jī)酸根的積累而使乳酸菌培養(yǎng)達(dá)到理想的活菌濃度。目前公開(kāi)的專利顯示，現(xiàn)有乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的乳酸菌活菌濃度基本在1.0X 101°~1.0X 10ncfu/mL，而無(wú)法突破1.0X 10ncfU/mL。近幾年，膜濾培養(yǎng)對(duì)提高乳酸菌活菌量取得了較好的進(jìn)展，但是微濾膜的造價(jià)成本高，膜濾過(guò)程中膜的堵塞、污染嚴(yán)重，膜的清洗耗時(shí)、耗力。并且在膜濾培養(yǎng)過(guò)程中，雖然通過(guò)循環(huán)過(guò)濾濾除了培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物，但同時(shí)亦濾掉了培養(yǎng)基中大量未被利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，這些因素均限制了膜濾培養(yǎng)技術(shù)的工業(yè)化推廣。
[0004]如何簡(jiǎn)單、有效地去除乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中酸根的積累是乳酸菌高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵，而離子交換技術(shù)可以很好地解決此問(wèn)題。經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理并轉(zhuǎn)型為氫氧型的弱堿性陰離子交換樹(shù)脂，可以選擇性吸附掉乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中代謝的酸根，同時(shí)置換出一個(gè)0H-，中和H+。20世紀(jì)，離子交換技術(shù)得到了飛速發(fā)展，已經(jīng)由最初僅應(yīng)用于水處理行業(yè)，發(fā)展到食品加工、環(huán)境科學(xué)和發(fā)酵工程等各行各業(yè)。本發(fā)明首次將樹(shù)脂脫酸與菌體培養(yǎng)過(guò)程相耦合，成功提高了菌體密度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于離子交換的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法，是將弱堿性陰離子交換樹(shù)脂耦合到乳酸菌的培養(yǎng)過(guò)程中，離子交換時(shí)酸根被吸附，置換出OH+與H+結(jié)合，以同時(shí)解除H+和酸根對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的抑制作用，顯著提高乳酸菌活菌量。[0006]所述乳酸菌包括:干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)。
[0007]所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂包括:D319大孔型丙烯酸系弱堿性陰離子交換樹(shù)脂、D311大孔型丙烯酸系弱堿性陰離子交換樹(shù)脂或331凝膠型環(huán)氧系弱堿性陰離子交換樹(shù)脂，上述樹(shù)脂對(duì)乳酸、乙酸的吸附容量均高于1.5mmoL/mL (濕)，且對(duì)葡萄糖和氨基酸吸附量少，選擇性好，再生容易。將其耦合到乳酸菌的培養(yǎng)過(guò)程中，從根本上解除了乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中的抑制因素。所述樹(shù)脂D319購(gòu)自江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司，樹(shù)脂D311、331購(gòu)自安徽三星樹(shù)脂科技有限公司。
[0008]所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂經(jīng)預(yù)處理和轉(zhuǎn)型，以確保樹(shù)脂為無(wú)菌狀態(tài)，且由出廠時(shí)的氯型轉(zhuǎn)化為氫氧型，以實(shí)現(xiàn)離子交換時(shí)酸根被吸附，置換出OH+與H+結(jié)合，解除H+和酸根抑制，且無(wú)新的離子進(jìn)入培養(yǎng)液。
[0009]所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理和轉(zhuǎn)型步驟是:
[0010](1)自來(lái)水反洗陰離子交換樹(shù)脂，去除雜物和細(xì)小的樹(shù)脂顆粒，直到反洗出水澄
清。
[0011](2)通入2~4倍樹(shù)脂體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%~6%的NaOH溶液，然后浸泡8~12小時(shí)，排去堿液，用純凈水沖洗至出水呈中性。
[0012](3)通入2~4倍樹(shù)脂體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%~6%HC1的溶液，然后浸泡4~8小時(shí)，排去酸液，用純凈水沖洗至出水呈中性。
[0013](4)重復(fù)第(2)步,浸泡8~12小時(shí)后用10~20倍樹(shù)脂體積的無(wú)菌水沖洗,洗至中性，無(wú)菌環(huán)境下保藏備用。
[0014]所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂通過(guò)發(fā)酵罐控制器的pH值自動(dòng)控制系統(tǒng)自動(dòng)添加，設(shè)定控制點(diǎn)為pH值6.2，使培養(yǎng)液pH值穩(wěn)定在6.2~7.0。每3~5個(gè)小時(shí)開(kāi)啟蠕動(dòng)泵讓培養(yǎng)液以通過(guò)無(wú)菌的中壓特制玻璃層析柱(5cmX40cm)，以濾除培養(yǎng)液中積累的樹(shù)脂，含菌的培養(yǎng)液則回流到發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0015]所述高密度培養(yǎng)方法在菌種培養(yǎng)過(guò)程中還間歇補(bǔ)充碳源和氮源，保證乳酸菌生長(zhǎng)得到充分的營(yíng)養(yǎng)。所述碳源、氮源的補(bǔ)加:培養(yǎng)過(guò)程中每Ih取5~1mL培養(yǎng)液，測(cè)定其葡萄糖和氨基氮含量。當(dāng)葡萄糖含量低于5g/L時(shí)，補(bǔ)加360~400g/L的葡萄糖，使葡萄糖含量保持在5~15g/L ;當(dāng)氨基氮含量低于0.2g/L時(shí),補(bǔ)加由牛肉膏、蛋白胨、酵母粉按質(zhì)量比為2:2:1組成的總濃度為200~250g/L的氮源，使氨基氮含量保持在0.2~0.8g/L。
[0016]所述高密度培養(yǎng)方法優(yōu)選以下步驟:
[0017](I)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理和轉(zhuǎn)型:確保樹(shù)脂為無(wú)菌狀態(tài)，且由出廠時(shí)的氯型轉(zhuǎn)化為氫氧型，以實(shí)現(xiàn)離子交換時(shí)酸根被吸附，置換出OH+與H+結(jié)合，解除H+和酸根抑制，且無(wú)新的離子進(jìn)入培養(yǎng)液。
[0018](2)乳酸菌的活化培養(yǎng)及高密度培養(yǎng):乳酸菌經(jīng)活化兩代后以體積百分比5%~10%的接種量接入發(fā)酵罐，37°C恒溫培養(yǎng)。厭氧菌須持續(xù)通入無(wú)菌氮?dú)猓瑫r(shí)開(kāi)啟排氣口保持罐內(nèi)常壓。
[0019](3)樹(shù)脂的添加控制:通過(guò)發(fā)酵罐控制器的pH值自動(dòng)控制系統(tǒng)自動(dòng)添加陰離子交換樹(shù)脂。設(shè)定控制點(diǎn)為PH值6.2，當(dāng)培養(yǎng)液pH值低于6.2時(shí)，pH值自動(dòng)控制系統(tǒng)控制的輸送泵啟動(dòng)，輸送樹(shù)脂進(jìn)入培養(yǎng)液，樹(shù)脂與酸根發(fā)生離子交換，培養(yǎng)液PH值升高，pH值高于
6.2時(shí)，輸送泵停止輸送樹(shù)脂。上述過(guò)程由發(fā)酵罐控制器的電腦系統(tǒng)自動(dòng)控制，培養(yǎng)液pH值始終穩(wěn)定在6.2~7.0。
[0020](4)吸附飽和樹(shù)脂的去除:每3~5個(gè)小時(shí)開(kāi)啟蠕動(dòng)泵讓培養(yǎng)液以200~300mL/min的速度循環(huán)通過(guò)無(wú)菌的中壓特制玻璃層析柱(5cmX40cm)，樹(shù)脂被底部篩網(wǎng)截留，含菌的培養(yǎng)液回流到發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。樹(shù)脂被完全濾除后停止過(guò)濾，開(kāi)啟層析柱底端，收集吸附飽和的樹(shù)脂用于乳酸的洗脫，空層析柱用于下次樹(shù)脂的濾除。
[0021](5)碳源、氮源的補(bǔ)加:培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)葡萄糖含量低于5g/L時(shí)，補(bǔ)加碳源使葡萄糖含量保持在5~15g/L ；當(dāng)氨基氮含量低于0.2g/L時(shí)，補(bǔ)加氮源使氨基氮含量保持在0.2~
0.8g/L。
[0022](6)乳酸 的洗脫:吸附飽和的樹(shù)脂經(jīng)自來(lái)水反復(fù)清洗至洗出液澄清，然后用1.0~
1.2倍樹(shù)脂體積的硫酸溶液(濃度10%~15%)浸泡過(guò)夜，濾出液可用于工業(yè)乳酸的生產(chǎn)。
[0023]經(jīng)本發(fā)明高密度培養(yǎng)方法培養(yǎng)乳酸菌，可使干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的最終活菌濃度達(dá)到3.0X 111~2.0X 1012cfu/mL，雙歧桿菌的最終活菌濃度達(dá)到 5.0XlO9 ~6.0X1010cfu/mLo
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):(1)中性環(huán)境下，酸根和氯鹽均會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，本發(fā)明充分利用了氫氧型弱堿陰離子交換樹(shù)脂選擇性吸附酸根后生成水且無(wú)其他離子引入培養(yǎng)液的特點(diǎn)，徹底解決了乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中H+和有機(jī)酸根積累對(duì)乳酸菌的抑制作用，大幅提高乳酸菌的活菌濃度；(2)發(fā)明中使用的樹(shù)脂價(jià)格便宜，吸附飽和的樹(shù)脂洗脫后，經(jīng)再生處理后可重復(fù)利用，顯著降低了成本；(3)樹(shù)脂吸附的乳酸經(jīng)洗脫可得到高濃度的乳酸，可用于工業(yè)乳酸的生產(chǎn)，本發(fā)明的方法在提高乳酸菌活菌量的同時(shí)增加了附產(chǎn)品——乳酸的生產(chǎn)；(4)碳源、氮源得到充分利用，顯著提高資源的利用率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是植物乳桿菌樹(shù)脂耦合培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)24h的生長(zhǎng)曲線。
[0026]圖2是植物乳桿菌樹(shù)脂耦合培養(yǎng)12h和分批補(bǔ)料培養(yǎng)24h的生長(zhǎng)曲線。
[0027]圖3是雙歧桿菌樹(shù)脂耦合培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)26h的生長(zhǎng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)
[0029](I)弱堿陰離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理和轉(zhuǎn)型
[0030]量取1L弱堿陰離子交換樹(shù)脂，按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分記載的處理方法進(jìn)行預(yù)處理和轉(zhuǎn)型(轉(zhuǎn)為氫氧型)，無(wú)菌環(huán)境下保藏備用。
[0031](2)種子液制備
[0032]從甘油保藏管中吸取200 μ L植物乳桿菌接入1mL MRS液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后以5%的接種量轉(zhuǎn)入10mLMRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化，37°C恒溫培養(yǎng)12h即得種子液。
[0033](3)接種前準(zhǔn)備及接種過(guò)程
[0034]配制MRS液體培養(yǎng)基2L倒入3L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐罐體放入高壓滅菌鍋中滅菌，待罐體冷卻至37°C在酒精火焰圈上方，將種子液以5%的接種量接種到發(fā)酵罐中，攪拌，37°C恒溫培養(yǎng)。
[0035](4)流加樹(shù)脂及吸附飽和樹(shù)脂的去除
[0036]當(dāng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)液pH低于6.2時(shí)，通過(guò)pH值自動(dòng)控制系統(tǒng)自動(dòng)添加經(jīng)無(wú)菌處理的弱堿陰離子交換樹(shù)脂，使培養(yǎng)液PH值始終保持在6.2~7.0 ;每3~5個(gè)小時(shí)，由蠕動(dòng)泵控制循環(huán)濾除培養(yǎng)液中積累的樹(shù)脂，含菌的培養(yǎng)液回流到發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0037](5)補(bǔ)料
[0038]培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)葡萄糖含量低于5g/L時(shí)，補(bǔ)加無(wú)菌葡萄糖(葡萄糖濃度400g/L)，使葡萄糖含量保持在5~15g/L ;當(dāng)氨基氮含量低于0.2g/L時(shí)，補(bǔ)加無(wú)菌氮源(牛肉膏:蛋白胨:酵母粉=2:2:1，總濃度250g/L)，使氨基氮含量保持在0.2~0.8g/L。
[0039](6)乳酸的洗脫
[0040]吸附飽和的樹(shù)脂經(jīng)自來(lái)水反復(fù)清洗至洗出液澄清，然后用1.0~1.2倍體積的硫酸溶液(濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%~15%)浸泡過(guò)夜，濾出液可用于工業(yè)乳酸的生產(chǎn)，樹(shù)脂經(jīng)廠家提供再生方法進(jìn)行再生可重復(fù)利用。
[0041](7)最終活菌濃度
[0042]植物乳桿菌經(jīng)過(guò)上述方法培養(yǎng)，最終活菌數(shù)可達(dá)到5.6 X 111~2.8X 1012cfu/mL。
[0043]實(shí)施例2雙歧桿菌的高密度培養(yǎng)
[0044](I)弱堿陰離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理和轉(zhuǎn)型
[0045]量取5L弱堿陰離子交換樹(shù)脂，按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分記載的處理方法進(jìn)行預(yù)處理和轉(zhuǎn)型(轉(zhuǎn)為氫氧型)，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)裝入無(wú)菌瓶?jī)?nèi)。
[0046](2)種子液制備
[0047]從甘油保藏管中吸取200 μ L雙歧桿菌接入1mL MRS液體培養(yǎng)基(添加lg/L的半胱氨酸鹽酸鹽)，放入?yún)捬豕ぷ髡?7°C恒溫培養(yǎng)24h，然后以5%的接種量轉(zhuǎn)入10mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化，37°C恒溫厭氧培養(yǎng)15h即得種子液。
[0048](3)接種前準(zhǔn)備及接種過(guò)程
[0049]配制MRS液體培養(yǎng)基(添加lg/L的半胱氨酸鹽酸鹽)2L倒入3L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐罐體放入高壓滅菌鍋中滅菌，待罐體冷卻至37°C在酒精火焰圈上方，將種子液以10%的接種量接種到發(fā)酵罐中，連續(xù)通入無(wú)菌氮?dú)獗３殖海?7°C恒溫厭氧培養(yǎng)。
[0050](4)流加樹(shù)脂及吸附飽和樹(shù)脂的去除
[0051]當(dāng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)液pH低于6.2時(shí)，通過(guò)pH值自動(dòng)控制系統(tǒng)自動(dòng)添加經(jīng)處理的陰離子交換樹(shù)脂，使培養(yǎng)液PH值始終保持在6.2~7.0 ;每3~5個(gè)小時(shí)，由蠕動(dòng)泵控制循環(huán)濾除培養(yǎng)液中積累的樹(shù)脂，含菌的培養(yǎng)液回流到發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。(5)補(bǔ)料
[0052]培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)葡萄糖含量低于5g/L時(shí)，補(bǔ)加無(wú)菌葡萄糖(葡萄糖濃度400g/L)，使葡萄糖含量保持在5~10g/L ;當(dāng)氨基氮含量低于0.2g/L時(shí)，補(bǔ)加無(wú)菌氮源(牛肉膏:蛋白胨:酵母粉=2:2:1，濃度250g/L)，使氨基氮含量保持在0.2~0.5g/L。
[0053](6)乳酸和乙酸的洗脫
[0054]吸附飽和的樹(shù)脂經(jīng)自來(lái)水反復(fù)清洗至洗出液澄清，然后用1.0~1.2倍體積的硫酸溶液(濃度10%~15%)浸泡過(guò)夜，濾出液進(jìn)一步分離可用于工業(yè)乳酸和乙酸的生產(chǎn)，樹(shù)脂經(jīng)廠家提供的再生方法進(jìn)行再生可重復(fù)利用。[0055](7)最終活菌濃度
[0056]雙歧桿菌經(jīng)過(guò)上述方法培養(yǎng)，最終活菌濃度可達(dá)到5.2 X 19~4.8X 10lclcfu/mL。
[0057]實(shí)施例3干酪乳桿菌的高密度培養(yǎng)
[0058]嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)同實(shí)施例1，最終活菌濃度可達(dá)到
3.0XlO11 ~2.0X 1012cfu/mL。
[0059]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該 以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種乳酸菌高密度培養(yǎng)的方法，是將弱堿性陰離子交換樹(shù)脂耦合到乳酸菌的培養(yǎng)過(guò)程中，離子交換時(shí)酸根被吸附，置換出OH+與H+結(jié)合，以同時(shí)解除H+和酸根對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的抑制作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌包括:干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂包括:D319、D311或331弱堿性陰尚子交換樹(shù)脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂經(jīng)過(guò)預(yù)處理和轉(zhuǎn)型，由出廠時(shí)的氯型轉(zhuǎn)化為氫氧型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂通過(guò)發(fā)酵罐控制器的pH值自動(dòng)控制系統(tǒng)自動(dòng)添加，設(shè)定控制點(diǎn)為pH值6.2，使培養(yǎng)液pH值穩(wěn)定在6.2 ~7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，在菌種培養(yǎng)過(guò)程中還間歇補(bǔ)充碳源和氮源，保證乳酸菌生長(zhǎng)得到充分的營(yíng)養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高密度培養(yǎng)方法包括以下步驟: (1)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理和轉(zhuǎn)型:確保樹(shù)脂為無(wú)菌狀態(tài)，且由出廠時(shí)的氯型轉(zhuǎn)化為氫氧型； (2)乳酸菌的活化培養(yǎng)及高密度培養(yǎng):乳酸菌經(jīng)活化兩代后以體積百分比5%~10%的接種量接入發(fā)酵罐，37°C恒溫培養(yǎng)，厭氧菌須持續(xù)通入無(wú)菌氮?dú)猓瑫r(shí)開(kāi)啟排氣口保持罐內(nèi)常壓； (3)樹(shù)脂的添加控制:通過(guò)發(fā)酵罐控制器的pH值自動(dòng)控制系統(tǒng)自動(dòng)添加陰離子交換樹(shù)月旨，設(shè)定控制點(diǎn)為ρΗ6.2，使培養(yǎng)液pH值穩(wěn)定在6.2~7.0 ; (4)吸附飽和樹(shù)脂的去除:每3~5個(gè)小時(shí)，培養(yǎng)液循環(huán)通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾裝置，將培養(yǎng)液中添加積累的樹(shù)脂過(guò)濾除掉，含菌的培養(yǎng)液回流到發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)； (5)碳源、氮源的補(bǔ)加:培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)葡萄糖含量低于5g/L時(shí)，補(bǔ)加碳源使葡萄糖含量保持在5~15g/L ;當(dāng)氨基氮含量低于0.2g/L時(shí)，補(bǔ)加氮源使氨基氮含量保持在0.2~0.8g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，吸附飽和的樹(shù)脂經(jīng)自來(lái)水反復(fù)清洗至洗出液澄清，然后用1.0~1.2倍樹(shù)脂體積的硫酸溶液浸泡過(guò)夜，濾出液用于工業(yè)乳酸的生產(chǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或7所述的方法，其特征在于，所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理和轉(zhuǎn)型步驟是: (1)自來(lái)水反洗陰離子交換樹(shù)脂，去除雜物和細(xì)小的樹(shù)脂顆粒，直到反洗出水澄清； (2)通入2~4倍樹(shù)脂體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%~6%的NaOH溶液，然后浸泡8~12小時(shí)，排去堿液，用純凈水沖洗至出水呈中性； (3)通入2~4倍樹(shù)脂體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%~6%HCl的溶液，然后浸泡4~8小時(shí)，排去酸液，用純凈水沖洗至出水呈中性； (4)重復(fù)第(2)步，浸泡8~12小時(shí)后用10~20倍樹(shù)脂體積的無(wú)菌水沖洗，洗至中性，無(wú)菌環(huán)境下保藏備用。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳源、氮源的補(bǔ)加:培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)葡萄糖含量低于5g/L時(shí)，補(bǔ)加360~400g/L的葡萄糖，使葡萄糖含量保持在5~15g/L ;當(dāng)氨基氮含量低于0.2g/L時(shí)，補(bǔ)加由牛肉膏、蛋白胨、酵母粉按質(zhì)量比為2:2:1組成的總濃度為200~250g/L的氮源，使氨基氮含量保持在0.2~0.8g/L。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104031857SQ201410156230
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 崔樹(shù)茂, 張灝, 趙建新, 田豐偉, 王剛, 張秋香, 范大明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)