水牛產奶性狀mc4r基因的克隆及作為分子標記的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了水牛產奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標記的應用。特征是克隆得到的序列如SEQ?ID?NO：1所示，檢測到3個影響水牛產奶性狀的堿基突變，分別是第226bp處的C226-T226、1104bp處的C1104-T1104和1525bp處的A1525-G1525。本發明的優點：本發明公開了水牛基因MC4R序列、影響水牛產奶性狀的3個堿基突變位點和獲得上述基因的獲取方法及其應用，為水牛產奶性狀標記輔助選擇提供了新的分子標記。
【專利說明】水牛產奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標記的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于動物基因工程【技術領域】，具體涉及水牛產奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標記的應用。
【背景技術】
[0002]水牛是我國南方特有的種畜資源，而較低的產奶量和繁殖性能已成為了影響其產業發展的兩大科學問題。顯然，利用先進的分子標記技術應用于優良奶水牛種質資源的選育將會有效的提聞選種效率。
[0003]產奶性狀是奶水牛的一個重要經濟性狀，由多種微效基因決定，是一種典型的由多基因控制的數量性狀?？寺∧趟Ｃ谌樾阅芟嚓P基因并探討其遺傳特性，以提高奶水牛生產性能，為選育具有高產奶量的優良的奶水牛品種提供技術支撐和奠定理論基礎。
[0004]黑素皮質素受體(Melanoeortin Receptors, MCRs)家族是目前所知的最小的G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor, GPCR)亞家族，它們均屬于A類7個跨膜α螺旋G蛋白受體，是一系列小基因的產物。到目前為止，共有5個黑素皮質素受體基因(MC1R-MC5R)被克隆、鑒 定和定位，其中MC3R和MC4R在控制食欲和體重穩態中具有重要作用，且MC4R在動物體重、采食量和能量穩態的控制中具有重要作用，在人、豬和馬等哺乳動物中主要影響機體脂肪、增重、采食等性狀(仇雪梅等，2002)。根據MC4R基因功能，該基因可作為影響水牛產奶性狀的候選基因，用于分子標記的開發和利用，為建立分子標記輔助選擇技術奠定基礎。
[0005]迄今為止，尚無有關水牛MC4R基因作為水牛產奶性狀的分子標記。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于圍繞我國水牛品種產奶量較低的問題，提供水牛產奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標記的應用。通過克隆獲得水牛產奶性狀相關基因MC4R，對該基因進行多態性分析，為水牛的標記輔助選擇提供分子標記。
[0007]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0008]1.水牛產奶性狀基因MC4R作為分子標記，所述MC4R基因的核酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0009]2.SEQ ID NO:1第226bp處C226-T226的堿基突變，與水牛產奶量極顯著相關(ρ〈0.01)，第1104bp處的C1104-T1104和1525bp處的A1525-G1525堿基突變，與水牛產奶
量顯著相關(P〈0.05)。
[0010]3.本發明水牛產奶性狀相關基因MC4R獲取的具體步驟如下:
[0011](I)利用RNAiso試劑盒(Takara, Daliang, China)從成年的水牛脂肪組織中提取總RNA，并進行質控以及于_20°C保存。
[0012](2)根據已報道的牛MC4R基因序列(GenBank:FJ430565.1)，利用Primer5.0引物設計軟件，經Oligo軟件檢測，確定引物，并委托大連寶生物技術有限公司合成。其中用于擴增所述基因的正反向引物的DNA序列如下所示:
[0013] 正向引物:
[0014]5 ‘-GCTCGACGGAGAAGAAGCAT-3，；
[0015]5 ‘-GGCCATGAGGAACATGTGGA-3，；
[0016]5 ‘-TTGCCCAGTCTCGGTGTATT-3’ ；
[0017]反向引物:
[0018]5 ^-CTGCCTCATCACCGTGTTCT-3?；
[0019]5 ‘-AGACTGGGCACTGTTTCACA-3，；
[0020]5 ‘-CAACTTCTGCACAGGAAGAATGA-3，；
[0021]并委托大連寶生物技術有限公司合成。
[0022]3.將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據產物大小判定結果；將擴增產物克隆至PMD-18T，挑取陽性克隆委托深圳華大科技有限公司測序，結合生物信息學分析獲取水牛MC4R基因核苷酸序列。
[0023]4.本發明水牛產奶性狀相關基因MC4R作為分子標記的應用，具體步驟如下:
[0024](I)對待選育水牛進行靜脈采取提取總DNA ;根據水牛家族系譜和產奶記錄，選取5頭高產水牛O 2000kg/泌乳期)和5頭低產水牛(< 1000kg/泌乳期)，用于下一步驟水牛MC4R基因SNP位點的篩選；
[0025](2)根據水牛MC4R基因序列，利用SEQ ID NO: 2~7所示的引物，對上述10頭水牛DNA樣品進行PCR擴增，取5 μ L PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品送至深圳華大科技有限公司測序。
[0026](3)利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析軟件對測序結果進行比對,獲取候選的SNP位點。
[0027](4)根據候選的SNP位點信息，針對剩余的水牛血液總DNA樣品委托廣州英濰捷基生物有限公司開展飛行時間質譜儀檢測基因分型試驗，利用Typer4.0軟件檢測質譜峰，并根據質譜峰圖判讀各樣本位點基因型。根據SNP基因分型檢測結果與水牛產奶性狀進行關聯分析的應用。
[0028]本發明的優點:
[0029](I)本發明所述的分子標記為水牛分子標記輔助育種提供了新的分子標記。實驗結果證實了 MC4R基因有3個SNP位點與水牛的產奶量相關。
[0030](2)本發明采用了飛行時間質譜儀檢測法開展了水牛MC4R基因SNP分型檢測，該法具有檢測樣品高通量，快速和準確等優勢，為開展水牛分子標記輔助選擇技術的建立等研究奠定了堅實的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是用水牛MC4R基因PCR反應瓊脂糖電泳檢測圖。瓊脂糖凝膠電泳濃度為
1.5%。圖中，M是DL2000marker，l、2和3分別代表3個基因片段，其大小分別為894bp、592bp 和 38 Ibp ；
[0032]圖2是MC4R C226T位點飛行質譜檢測結果圖。圖中，倒三角形CC為野生型，正方形TC為雜合子個體，尚未檢測到突變純合子個體?！揪唧w實施方式】
[0033]下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。以下實施例僅對本發明作進一步說明，不應理解為對本發明的限制。實施例中所述實驗方法如無特別說明，均為常規方法。
[0034]實施例1
[0035]水牛產奶性狀相關基因MC4R的獲取
[0036]1、水?；蚪M總DNA的制備
[0037]采用血液基因組DNA提取試劑盒制備水?；蚪M總DNA (天根，北京)，
[0038]具體操作步驟如下:
[0039](I)取全血500yL置于1.5mL離心管，加入等體積的細胞裂解液CL，顛倒混勻，12000rpm離心lmin，吸取上清，留下沉淀；加入等體積的細胞裂解液CL，重復此步驟一次；加入 4 μ L RNAase (100mg/mL),振蕩 15sec,室溫靜置 5min ；
[0040](2)加入20 μ L Proteinase K溶液，混勻，加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C放置lOmin，期間顛倒混勻數次，溶液應變清亮；
[0041](3)加入200 μ L無水乙醇，充分顛倒混勻；此時可能會出現絮狀沉淀；
[0042](4)將上述所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0043](5)向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶，12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0044](6)向吸附柱CB3中加入600 μ L漂洗液PW，12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；重復此操作一次；
[0045](7)12，OOOrpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0046](8)將吸附柱CB3轉入1.5mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200 μ L洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12，OOOrpm離心2min，將溶液收集到離心管中；
[0047](9)存放于_20°C冰箱中保存備用。
[0048]2、引物設計
[0049]以報道的牛MC4R基因序列(GenBank:FJ430565.1)為模板，利用Primer5.0引物設計軟件，經Olig0軟件檢測，確定用于擴增水牛MC4R基因的正方向引物，并委托大連寶生物技術有限公司合成，其中用于擴增所述基因的正反向引物的DNA序列如下所示:
[0050]正向引物:
[0051]5 ‘-GCTCGACGGAGAAGAAGCAT-3，；
[0052]5 ‘-GGCCATGAGGAACATGTGGA-3，；
[0053]5 ‘-TTGCCCAGTCTCGGTGTATT-3’ ；
[0054]反向引物:
[0055]5 ‘-CTGCCTCATCACCGTGTTCT-3，；
[0056]5 ‘-AGACTGGGCACTGTTTCACA-3，；
[0057]5 ‘-CAACTTCTGCACAGGAAGAATGA-3’ ；[0058]3、反轉錄PCR擴增反應
[0059]利用RNAiso試劑盒(Takara, Daliang, China)從成年的水牛脂肪組織中提取總RNA,具體操作方法參照RNAiso試劑盒說明書進行。
[0060]cDNA第一鏈的合成:反應總體積為20 μ L，首先將總RNAl μ g與Oligo dT Primer(50 μ Μ)1 μ L, dNTP Mixture (IOmM each) I μ L 以及 RNase free dH208 yL混合一離心管中，于65°C保溫5min后,冰上迅速冷卻，接著將上述離心管短暫離心后加入5X PrimerScriptII Buffer4 μ L, RNase Inhibitor(40U/μ L)0.5 μ L, PrimerScript II RTase (200U/μ L)I μ L以及RNase free dH204.5 μ L,緩慢混勻，于42°C溫育60min后95°C滅活5min，冰上冷卻，之后置于-20°C保存備用。
[0061 ] PCR反應:反應總體積為20 μ L，其中水牛cDNA模板I μ L，IOX PCR Buffer112 μ L，dNTP MixturedOmM each) 2 μ L，Takara Ex Taq HS (5U/μ L) 0.5 μ L 以及 RNasefree dH2014.5μ L。反應條件為:94°C /3min ；94°C /30sec,60°C /30sec,72°C /1-1.5min,30 個循環；72°C IOmin0
[0062]4、PCR產物的檢測、純化、克隆和測序
[0063]將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據產物大小判定結果，其擴增產物凝膠電泳結果如圖1所示；PCR產物的純 、克隆和測序等步驟均為常規方法。
[0064]5、DNA序列同源性檢索與鑒定
[0065]利用NCBI (http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/)網站的 BLAST 工具對測序結果進行分析，判定結果的真實性。以基因片段I為例，根據牛與水牛的親緣進化關系，BLAST nr/nt比對結果顯示，查詢序列(基因片段I)與Bos Taurus MC4R基因mRNA序列具有高度同源性，比對值達98%。故，查詢序列(基因片段I)可鑒定為水牛的MC4R基因的部分序列。
[0066]實施例2
[0067]水牛MC4R基因分子標記的篩選與檢測
[0068]1、水牛MC4R基因分子標記的初篩
[0069]根據水牛家族系譜和產奶記錄，選取5頭高產水牛O 2000kg/泌乳期)和5頭低產水牛(≤1000kg/泌乳期)為分子標記初篩對象；利用SEQ ID NO:2~7所示的引物序列對上述10頭水牛DNA樣品進行PCR擴增，取5 μ L PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品送至深圳華大科技有限公司測序；利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析軟件對測序結果進行拼接和比對，初步篩選與水牛產奶性狀相關基因MC4R基因分子標記(見表1)，共有13個位點發生堿基突變，其中5個位于5’ UTR，外顯子I有5個，3’ UTR有3個。
[0070]表1水牛MC4R基因篩選SNP信息表
[0071]
【權利要求】
1.水牛產奶性狀MC4R基因作為分子標記，其特征在于，所述MC4R基因的核酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
2.根據權利要求1所述MC4R基因，其特征在于:SEQID NO:1第226bp處C226-T226的堿基突變，與水牛產奶量極顯著相關；第1104bp處的C1104-T1104和1525bp處的A1525-G1525堿基突變，與水牛產奶量顯著相關。
3.獲取權利要求1所述基因MC4R的獲取方法，其特征在于操作步驟如下: (1)利用購自于大連寶生物有限公司的RNAiso試劑盒從成年的水牛脂肪組織中提取總RNA，并進行質控以及于_80°C保存； (2)以牛MC4R基因序列為模板，其NCBI登錄號為:FJ430565.1，利用Primer5.0軟件設計引物，經Oligo軟件檢測， 確定用于擴增水牛MC4R基因的正反向引物，其序列如下所示: 正向引物:
5 ‘-GCTCGACGGAGAAGAAGCAT-3，；
5 ‘-GGCCATGAGGAACATGTGGA-3，；
5 ‘-TTGCCCAGTCTCGGTGTATT-3’ ； 反向引物:
5 ‘-CTGCCTCATCACCGTGTTCT-3’ ；
5 ‘-AGACTGGGCACTGTTTCACA-3’ ；
5 ‘-CAACTTCTGCACAGGAAGAATGA-3’ ； 并委托大連寶生物技術有限公司合成； (3)反轉錄PCR反應:cDNA第一鏈的合成:反應總體積為20μ L，首先將總RNAl μ g與50 μ M的Oligo dT Primerl μ L, each I OmM 的 dNTP Mixturel μ L 以及 RNase free dH208 μ L混合一離心管中，于65°C保溫5min后，冰上迅速冷卻，接著將上述離心管短暫離心后加A 5X PrimerScript II Buffer4 μ L,40U/μ L 的 RNase Inhibitor0.5 μ L,200U/μ L 的PrimerScript II RTasel μ L 以及 RNase free dH204.5 μ L,緩慢混勻，于 42°C溫育 60min后95°C滅活5min，冰上冷卻，之后置于_20°C保存備用； PCR反應:反應總體積為20 μ L，其中水牛cDNA模板I μ L，IOX PCR Buffer 112 μ L，eachlOmM 的 dNTP Mixture2 μ L, 5U/ μ L 的 Takara Ex Taq HS0.5μ L 以及 RNase freedH2014.5 μ L，反應條件為:94°C /3min ；94°C /30sec,60°C /30sec, 72°C /I ~1.5min, 30 個循環；72°C IOmin ； (4)將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據產物大小判定結果；將擴增產物克隆至PMD-18T，挑取陽性克隆委托深圳華大科技有限公司測序，結合生物信息學分析獲取水牛MC4R基因核苷酸序列。
4.權利要求2所述的分子標記在水牛分子標記輔助選擇育種中的應用，其特征在于，操作步驟如下: (1)對397頭水牛進行靜脈采血提取總DNA，對其進行質控，調整DNA終濃度在30~50ng/l.! L之間，于-20°C保存；根據水牛家族系譜和產奶記錄，選取5頭高產水牛，產奶量為305d大于或等于2000kg，以及5頭低產水牛，產奶量為305d小于或等于1000kg，用于下一步驟水牛MC4R基因SNP位點的篩選； (2)利用SEQID NO:2~7所示引物對上述10頭水牛DNA樣品進行PCR擴增，取5μ LPCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品委托深圳華大科技有限公司測序； (3)利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析軟件對測序結果進行拼接和比對，獲取候選的SNP位點，其中有13個位點發生堿基突變，5個位于5’ UTR,外顯子I有5個，3’ UTR有3個； (4)針對上一步驟中候選的SNP位點，利用SequenomMassARRAY技術對上述水牛群體DNA樣本進行SNP分型檢測，根據質譜峰圖判讀各樣本位點基因型； (5)利用SAS9.2軟件開展SNP基因分型檢測結果與水牛產奶量的相關性分析。
【文檔編號】C12N15/10GK103923997SQ201410160033
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】龐春英, 鄧廷賢, 梁賢威, 楊炳壯, 劉滿清, 陳明棠, 黃健, 譚正準, 李輝 申請人:廣西壯族自治區水牛研究所