總狀毛霉的新應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及總狀毛霉在水解大豆異黃酮產生游離型苷元中的應用。本發明還提供了總狀毛霉水解大豆異黃酮產生游離型苷元的方法。本發明提供了總狀毛霉在水解大豆異黃酮產生游離型苷元中的新用途，酶解效率高，可用于制備大豆異黃酮的游離型苷元，為游離型苷元的制備開拓了一條新思路，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】總狀毛霉的新應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物領域，涉及一種總狀毛霉的新應用，特別涉及總狀毛霉在水解大豆異黃酮產生游離型苷元中的應用。
【背景技術】
[0002]大豆異黃酮具有防癌，防骨質疏松癥，改善婦女更年期綜合癥，防心血管疾病等諸多生理功能，是近年來世界各國科學家研究的熱點。大豆中的大豆異黃酮近99%是以β-葡萄糖苷形式存在，只有1%左右為游離型苷元。糖苷型的活性低，很難被人體直接吸收，必須要經過人體微生物的水解作用生成苷元形式才易被吸收。體外實驗也表明，大豆異黃酮苷元比大豆異黃酮苷具有更好的雌激素樣生物活性。因此，將結合型糖苷水解成游離型苷元是提高大豆異黃酮生理活性一個有效的手段。目前常用水解方法主要有酸水解、堿水解、酶水解。大豆異黃酮苷雖然可在堿性條件下水解成相應的苷元和葡萄糖，但堿水解所得到的大豆異黃酮苷元很不穩定，容易降解。酸水解效率雖高，但工業化生產條件要求嚴格，增加了基礎建設的投資。相對而言酶水解條件比較溫和，但單純通過應用工業酶法生產苷元的成本都很昂貴。β_葡萄糖苷酶是廣泛存在于人的消化道、植物和400多種微生物中的一種酶，可以水解異黃酮成為苷元。大豆自身也含有葡萄糖苷酶，但水解活性不強。但利用微生物發酵的方法可以提高大豆自身β_葡萄糖苷酶的活性，發酵不影響總異黃酮含量同時直接產生苷 元，該法可大幅度降低成本，為工業化生產提供便利條件。
[0003]目前報道的可以產生游離苷元的微生物有:淺玫瑰鏈霉菌、紅色糖多孢菌、灰色鏈霉菌、黑曲霉等。總狀毛霉是真核類微生物，可以分泌蛋白酶，目前已經發現總狀毛霉可以用于制備腐乳，以及具有轉化留體藥物中間體的功能，國內外文獻中尚未見總狀毛霉在大豆異黃酮轉化方面的相關報道。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供了一株總狀毛霉的新應用，用于水解大豆異黃酮產生游離型苷元。
[0005]本發明的第二目的是提供總狀毛霉水解大豆異黃酮產生游離型苷元的方法。
[0006]本發明通過以下技術方案來實現:
一、一株總狀毛霉在水解大豆異黃酮產生游離型苷元中的應用。
[0007]本發明中所采用的總狀毛霉CK racemosus) ACCC 0401,由中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物保藏中心(簡稱ACCC)鑒定。
[0008]二、上述的總狀毛霉水解大豆異黃酮產生游離型苷元的方法，該方法包括以下步驟:
(O總狀毛霉的發酵；將總狀毛霉在無菌的條件下接入斜面培養基，30°c培養72h。種子培養:無菌條件下將斜面菌種接入種子培養基，30°C,搖床160 r.mirT1,培養48h。發酵培養:將液體種子培養基接入發酵培養基中，搖床160 r.min'SOt:培養72h。[0009] (2)發酵后的總狀毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，壓濾取濾液，4°C條件下低溫離心20min，獲得含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體；
(3)加入大豆異黃酮，每100mg大豆異黃酮添加50-250mg的總狀毛霉菌體，在pH5.0-6.5，溫度30-60 °C的條件下水解2_4 h以產生游離型苷元。
[0010]進一步的，所述的步驟(3)中的水解時間為3.59 h，以期達到更好的水解效果。
[0011]進一步的，所述的步驟(3)中的pH為6.1，以期達到更好的水解效果。
[0012]進一步的，所述的步驟(3)中的總狀毛霉菌體的用量為每IOOmg大豆異黃酮添加115mg的總狀毛霉菌體，以期達到更好的水解效果。
[0013]進一步的，所述的步驟(3)中的水解溫度46 °C，以期達到更好的水解效果。
[0014]進一步的，上述的總狀毛霉水解大豆異黃酮產生游離型苷元的方法，該方法包括以下步驟:
(1)總狀毛霉的發酵；
(2)發酵后的總狀毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，壓濾取濾液，4°C條件下低溫離心20min,獲得含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體；
(3)加入大豆異黃酮,每IOOmg大豆異黃酮添加115mg的總狀毛霉菌體,在pH6.1,溫度46 °C的條件下水解3.59 h以產生游離型苷元。
[0015]采用上述技術方案的積極效果:本發明提供了總狀毛霉在水解大豆異黃酮產生游離型苷元中的新用途，酶解效率高，可用于制備大豆異黃酮的游離型苷元，為游離型苷元的制備開拓了一條新思路，具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0016]本發明中生物材料的來源說明:
1、總狀毛霉(私racemosus)kCCC 0401:總狀毛霉對4-烯-3-酮甾體的生物轉化研究，葛文中，李楠，單麗紅，劉宏民，微生物學報，2007年6月4日第47卷第3期，540-543頁，該菌種由黑龍江八一農墾大學生命科技學院葛文中老師贈送給本 申請人:，并由 申請人:保證從本申請日起二十年內向公眾發放該生物材料。
[0017]2、黑曲霉ATCC16404、黃綠木霉ACCC30169購于上海復祥生物科技有限公司。
[0018]下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但不應理解為對本發明的限制:
實施例1
本實施例說明總狀毛霉菌體的獲取。
[0019]將總狀毛霉在無菌的條件下接入斜面培養基，30°C培養72h。種子培養:無菌條件下將斜面菌種接入種子培養基，30°C，搖床160 r.min—1，培養48h。發酵培養:將液體種子培養基接入發酵培養基中，搖床160 r.mirT1，30°C培養72h。
[0020]其中，斜面培養基:馬鈴薯浸粉5g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，121°C滅菌20min。種子培養基:可溶性淀粉2%，葡糖糖1%，磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.1%,酵母膏0.5%，硝酸鈉0.2%，121。。滅菌20min。產酶發酵培養基:脫脂豆柏4%，麩皮2%，蛋白胨0.1%，硫酸銨0.1%，磷酸二氫鉀0.1%，醋酸鈉0.1%，抗壞血酸0.1%，硫酸鎂0.1%，121°C滅菌20mino[0021]將上述發酵后的總狀毛霉發酵液連同菌絲磨碎打漿，于45°C水浴浸提1.5h，壓濾取濾液，于4°C條件下低溫離心20min，獲得含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體。
[0022]實施例2
將實施例1制備的含有β-葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體稀釋成濃度為5mg.mL—1，然后稱取IOOmg大豆異黃酮粉，加入含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體IOml,即50mg的總狀毛霉菌體，在PH5.5，水解溫度50 V的條件下水解2 h，將上述水解液取出煮沸滅酶活，濾紙過濾，用乙酸乙酯萃取兩次，然后用旋轉蒸發儀蒸發后，加入5ml色譜甲醇，然后將其混合，放入IOml容量瓶中定容。取適量經過濾器過濾，上機檢測。色譜柱為kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流動相:甲醇-水(30: 70)，流速為 1.0Oml
?mirT1,檢測波長為260nm,柱溫為25°C。進樣量:10μ1,保留時間為IOmin,對大豆異黃酮苷元進行測定，得到苷元濃度為18.32mg.mL'
[0023]實施例3
將實施例1制備的含有β-葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體稀釋成濃度為5mg.mL—1，然后稱取IOOmg大豆異黃酮粉,加入含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體30ml,即150mg的總狀毛霉菌體，在PH6.5，水解溫度60 V的條件下水解2.5 h，將上述水解液取出煮沸滅酶活，濾紙過濾，用乙酸乙酯萃取兩次，然后用旋轉蒸發儀蒸發后，加入5ml色譜甲醇，然后將其混合，放入IOml容量瓶中定容。取適量經過濾器過濾，上機檢測。色譜柱為kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流動相:甲醇-水(30: 70),流速為 1.0Oml
?mirT1,檢測波長為260nm,柱溫為25°C。進樣量:10μ1,保留時間為IOmin,對大豆異黃酮苷元進行測定，得到苷元濃度為21.51mg.mL'
[0024]實施例4
將實施例1制備的含有β-葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體稀釋成濃度為5mg.mL—1，然后稱取IOOmg大豆異黃酮粉,加入含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體23ml,即115mg的總狀毛霉菌體，在PH6.1，水解溫度46 V的條件下水解3.59 h，將上述水解液取出煮沸滅酶活，濾紙過濾，用乙酸乙酯萃取兩次，然后用旋轉蒸發儀蒸發后，加入5ml色譜甲醇，然后將其混合，放入IOml容量瓶中定容。取適量經過濾器過濾，上機檢測。色譜柱為kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流動相:甲醇-水(30: 70)，流速為 1.0Oml
?mirT1,檢測波長為260nm,柱溫為25°C。進樣量:10μ1,保留時間為IOmin,對大豆異黃酮苷元進行測定，得到苷元濃度為24.58 mg.mL'
[0025]實施例5
將實施例1制備的含有β-葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體稀釋成濃度為5mg.mL—1，然后稱取IOOmg大豆異黃酮粉，加入含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體50ml,即250mg的總狀毛霉菌體，在PH5.0，水解溫度40 °C的條件下水解4 h，將上述水解液取出煮沸滅酶活，濾紙過濾，用乙酸乙酯萃取兩次，然后用旋轉蒸發儀蒸發后，加入5ml色譜甲醇，然后將其混合，放入IOml容量瓶中定容。取適量經過濾器過濾，上機檢測。色譜柱為kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流動相:甲醇-水(30: 70)，流速為 1.0Oml
?mirT1,檢測波長為260nm,柱溫為25°C。進樣量:10μ1,保留時間為IOmin,對大豆異黃酮苷元進行測定，得到苷元濃度為22.6 mg.mL'
[0026]實施例6將實施例1制備的含有β-葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體稀釋成濃度為5mg.mL—1，然后稱取IOOmg大豆異黃酮粉，加入含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體40ml,即200mg的總狀毛霉菌體，在PH5.5，水解溫度30 V的條件下水解3.5h，將上述水解液取出煮沸滅酶活，濾紙過濾，用乙酸乙酯萃取兩次，然后用旋轉蒸發儀蒸發后，加入5ml色譜甲醇，然后將其混合，放入IOml容量瓶中定容。取適量經過濾器過濾，上機檢測。色譜柱為kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流動相:甲醇-水(30: 70)，流速為 1.0Oml
?mirT1,檢測波長為260nm,柱溫為25°C。進樣量:10μ1,保留時間為IOmin,對大豆異黃酮苷元進行測定，得到苷元濃度為21.91 mg.mL'
[0027]由實施例2-6可得,在水解時間3.59 h,pH6.1,每IOOmg大豆異黃酮添加115mg的總狀毛霉菌體，水解溫度46 °C的條件下，總狀毛霉可以很好的水解大豆異黃酮制備游離型苷元。
[0028]對比例
按照上述方法，在水解時間3.59 h,pH6.1,每IOOmg大豆異黃酮添加115mg的菌體,水解溫度46 1:的條件下，對黑曲霉ATCC16404、總狀毛霉ACCC 0401、黃綠木霉八01:30169三種菌進行對比實驗，以總狀毛霉ACCC 0401的效果最佳，水解大豆異黃酮制備游離型苷元的產量為黑曲霉ATCC16404或黃綠木霉ACCC30169的4_5倍，該菌種的新應用為游離型苷元的制備開拓了一條新思路。
【權利要求】
1.一株總狀毛霉在水解大豆異黃酮產生游離型苷元中的應用。
2.權利要求1所述的總狀毛霉水解大豆異黃酮產生游離型苷元的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)總狀毛霉的發酵； (2)發酵后的總狀毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，壓濾取濾液，4°C條件下低溫離心20min,獲得含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體； (3)加入大豆異黃酮，每IOOmg大豆異黃酮添加50-250mg的總狀毛霉菌體，在pH5.0-6.5，溫度30-60 °C的條件下水解2_4 h以產生游離型苷元。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步驟(3)中的水解時間為3.59 h。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步驟(3)中的pH為6.1。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步驟(3)中的總狀毛霉菌體的用量為每IOOmg大豆異黃酮添加115mg的總狀毛霉菌體。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步驟(3)中的水解溫度46°C。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)總狀毛霉的發酵； (2)發酵后的總狀毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，壓濾取濾液，4°C條件下低溫離心20min,獲得含有β -葡萄糖苷酶的總狀毛霉菌體； (3)加入大豆異黃酮,每IOOmg大豆異黃酮添加115mg的總狀毛霉菌體,在pH6.1,溫度46 °C的條件下水解3.59 h以產生游離型苷元。
【文檔編號】C12P17/06GK103923956SQ201410162022
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】李麗陽, 吳志軍, 葛文中, 阮洪生 申請人:黑龍江八一農墾大學