一種地龍的dna條形碼分子鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法和其COI序列，使用該方法進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出樣品COI基因，PCR產物經過瓊脂糖膠進行驗證后送至生物測序公司進行測序，將測序結果通過手工校對、序列拼接，并與公開序列進行比對，如果與所述基因序列SEQ?ID?NO.1-NO.4的同源性在99％以上，即可判斷所述的待測組織即為廣地龍或者滬地龍來源。本發明采用可靠的DNA分子鑒定技術，無需對地龍品種進行形態學鑒定，可以快速、準確的鑒定《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種和非藥材地龍品種，此外可以進一步區分廣地龍和滬地龍品種，增強了準確性和可靠性，確保地龍作為藥材了入藥的安全性。
【專利說明】—種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及物種鑒定領域，具體涉及地龍的DNA條形碼分子鑒定方法。
【背景技術】
[0002]地龍，即蚯蚓，性寒，味微咸，是傳統的中藥材，而《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)“地龍”項下收載的僅有環節動物門鉅蚓科動物參環毛蚓(Pheretimaaspergillum(E.Perrier))、通俗環毛蝴(Pheretima vulgaris Chen)、威廉環毛蟲引(Pheretima.guillelmi (Michaelsen))或木節肓毛蟲引(Pheretima pectinifera Michaelsen)的干燥體。前一種習稱“廣地龍”，后三種習稱“滬地龍”。地龍在《神農本草經》被列為下品，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功效。常炒制后用于高熱、神昏、驚癇抽搐、關節痹痛、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓等癥。李時珍在《本草綱目》稱之為具有通經活絡、活血化瘀、預防治療心腦血管疾病作用。現代研究表明，地龍含有多種藥理活性成分，藥理作用幾乎涉及人體各個系統，主要有抗血栓、溶栓和平喘、抗心律失常、降壓、增強免疫、抗潰瘍、解熱、消炎、鎮痛、免疫調節、促進創面愈合、鎮靜、抗腫瘤等多方面的藥理作用，臨床應用非常廣泛。
[0003]對地龍品種的鑒定是入藥的基礎，目前中藥材地龍的鑒定大多采用的是活體鑒別的方法，主要依據其外部形態和內部構造。但是由于動物類藥材大多外部形態相似，組織特征無特異性，而且經過產地粗加工和飲片炮制后，難以看出物種本身的形狀和顏色，顯微特征也有不同程度的破壞，造成地龍干品鑒別比較困難。因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統分類方法的缺陷。
[0004]DNA條形碼技術(DNA Barcoding)是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析，從而快速、準確地進行物種鑒定的技術。目前在動物中最常用的DNA barcode是細胞色素C氧化酶I號基因(COI)的部分序列。近幾年來，DNA條形碼技術已被證明是一個行之有效的生物鑒定手段，不僅可對傳統鑒定方法作強有力的補充，而且因為其更客觀、準確，突破以往對經驗的過度依賴，能幫助鑒定物種、發現新種和隱種、重建物種和高級階元的演化關系等。運用DNA條形碼技術，可以很好的對廣地龍和滬地龍的品種進行快速、有效的鑒定。
[0005]本發明提供一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法，無形態學觀察，可以快速準確鑒定《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種和非藥材地龍品種，保證中藥原材料的安全性。

【發明內容】

[0006]本發明克服目前以形態學鑒定地龍方法存在的缺陷，提高地龍鑒定結果的準確度，是一種易于操作、靈敏度高的鑒定方法。本發明的技術方案如下:
[0007]首先從采集的地龍樣品提取基因組DNA，利用一對引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出樣品一段COI基因，將擴增產物測序，然后進行序列分析比對，建立廣地龍和滬地龍的序列標準數據庫，在比較數據庫DNA的基礎上，通過分析聚合酶鏈式反應的產物結果，根據COI基因序列的差異，從而達到快速、準確鑒定地龍物種的目的。本發明設計的用于《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種和非藥材地龍品種鑒定方法，采用如下步驟:
[0008]1、提取地龍基因組DNA:按常規動物DNA提取方法或者血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.1 μ g/μ 1-2 μ g/ μ 10
[0009]2、擴增DNA片段，進行聚合酶鏈式反應，即用特異的引物進行擴增，引物對序列為
[0010]1X01490:5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0011 ] HC02198: 5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3':
[0012]擴增程序為94°C預變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個循環94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環72°C延伸5分鐘。
[0013]3、將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNAmarker檢測PCR片段大小。[0014]4、鑒定結果的判斷:若出現明顯清晰的709bp大小的條帶，且無雜帶，則可送生物測序公司測序。
[0015]5、將測序結果進行手工校對、序列拼接，如果與所述基因序列SEQ ID N0.1-SEQ IDN0.4，如果與任一序列同源性在99%以上，即可判斷所述的待測組織即為上述種屬。
[0016]其中，所述的地龍DNA條形碼分子鑒定方法采用的是血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒。
[0017]所述引物:
[0018]正向引物為5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，
[0019]反向引物為5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0020]所使用的DNA聚合酶為pfu高保真酶。
[0021 ] 所述的電泳為I % -2 %的瓊脂糖凝膠電泳。
[0022]所述的條帶大小需要用DNA maker檢測。
[0023]所述的DNA 序列拼接軟件包括 CodonCode Aligner、Sequencher> Genious、DNAstar等軟件。
[0024]與傳統的形態學鑒定方法相比，本發明獲得的基因序列有利于實現《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種和非藥材地龍品種的鑒定。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體的實施例對本發明做進一步說明:
[0026]1、地龍標本的采集與保存:采集的樣品來自廣西、上海等地。采獲的標本經10%酒精麻醉處理約20分鐘，再經75%酒精浸泡15分鐘處死并保存。
[0027]2、試驗樣品的前處理:取出保存于75 %酒精中的地龍標本，去內臟，避免內臟內容物的污染，剩余部分用蒸餾水浸泡清洗3次，洗去酒精，取尾部大約20mg解剖剪置入2mlEP管，加入磁珠，震蕩粉碎。蛋白酶K56°C溫浴I小時，至組織完全溶解。加入350 μ I氯仿:異戊醇(24: I)混勻，10，000Xg室溫離心5分鐘，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。
[0028]3、DNA模板制備:采用天根生物公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DNA進行提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.5 μ g/ μ I。
[0029]4、引物合成:本實施例所用引物如下:[0030]正向引物5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0031]反向引物5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0032]5、PCR擴增本實施例的PCR反應體系如下
[0033]PCR 反應體系為 25μ 1:ddH208.5uL，2XTaq PCR Master Mixl2.5uL，正向引物 /反向引物(2.5umol)各 luL，DNA 模板 2uL2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優化劑及穩定劑，濃度為2X，且不含染料；擴增程序:反應條件為94°C預變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個循環94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環72°C延伸5分鐘6、瓊脂糖電泳驗證PCR結果瓊脂糖電泳顯示樣品擴增良好，條帶清晰無雜質，可直接送生物測序公司進行測序。
[0034]6、測序結果序列拼接:將測序結果用CodonCode Aligner生物軟件，將序列導入，將引物剪切后將序列組裝，然后分別跟SEQ ID N0.1-4進行比對，Hl樣品與跟SEQ ID N0.1同源率100%，為廣地龍，參環毛蚓，屬于《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種；H2、H3序列與SEQ ID N0.2同源率100%，為滬地龍通俗環毛蚓，屬于《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種；H5、H6、H7樣品與SEQ ID N0.3同源率100%，為滬地龍威廉環毛蚓，屬于《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種；H8、H9與與SEQ ID N0.4同源率100%，為滬地龍櫛肓毛蚓，屬于《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種。
[0035]本發明所闡述的實施例并不是對本發明的限定，上述實施例和說明書中描述的僅為本發明的優選例，任何本領域技術人員根據常規手段可以預見或者微調的變化和改進，均落入本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法，其特征在于無需對地龍品種進行形態學鑒定，可以快速、準確的鑒定藥用地龍品種。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于可以區分鑒定廣地龍和滬地龍品種。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于可以區分鑒定滬地龍，包括通俗環毛蚓、威廉環毛蚓和櫛肓毛蚓。
4.根據權利要求1所述的方法為DNA條形碼分子鑒定方法，其步驟主要包括: (1)從待測的地龍樣品組織中分離提取基因組DNA； (2)以步驟(1)所提取的基因組DNA為模板用一對引物，通過聚合酶鏈式反應擴增； (3)然后取適量步驟(2)的聚合酶鏈式反應擴增出DNA產物用瓊脂糖電泳分離鑒定擴增產物大小，送生物測序公司測序； (4)將測序結果進行拼接，與所述基因序列SEQID N0.1-SEQ ID N0.4的同源性進行比對，同源性在99%以上，即可判斷鑒定地龍品種。
5.根據權利要求4所述的引物，其特征在于引物DNA的序列為:
LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ ；
HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
6.根據權利要求4所述聚合酶鏈式反應，其特征在于擴增條件為94°C預變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個循環；94°C變性I分鐘，50。。退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環；72°C延伸5分鐘。
7.根據權利要求4所述擴增產物，其特征在于擴增片段為709bp，用1%-2%瓊脂糖電泳檢測。
8.根據權利要求4所述的地龍DNA條形碼標準檢測基因序列，其特征在于所述條形碼標準檢測基因為COI基因，具有如下所述的廣地龍參環毛蚓基因序列SEQ ID N0.1 =AACACT
9.根據權利要求4所述的地龍DNA條形碼標準檢測基因序列，其特征在于所述條形碼標準檢測基因為COI基因，具有如下所述的滬地龍通俗環毛蚓基因序列SEQ ID N0.2 =GAAT
10.根據權利要求4所述的地龍DNA條形碼標準檢測基因序列，其特征在于所述條形碼標準檢測基因為COI基因，具有如下所述的滬地龍威廉環毛蚓基因序列SEQ ID N0.3 =GAAT
11.根據權利要求4所述的地龍DNA條形碼標準檢測基因序列，其特征在于所述條形碼標準檢測基因為COI基因，具有如下所述的滬地龍櫛肓毛蚓基因序列SEQ ID N0.4 =GAATAG
【文檔編號】C12Q1/68GK103898234SQ201410162028
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】李振國, 陳艷明, 務勇圣 申請人:牡丹江友搏藥業股份有限公司