一種拆分外消旋亮氨酸的方法
【專利摘要】本發明是一種拆分外消旋亮氨酸的方法，該方法以酶法拆分外消旋亮氨酸即DL-亮氨酸制備左旋亮氨酸和右旋亮氨酸，具體包括以下步驟：第一步：以外消旋亮氨酸為原料，按照亞硫酰氯法制備DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽；第二步：將DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽溶于堿性水溶液中，加入脂肪酶，在30～40℃溫度下酶催化水解5～10小時，再逐漸冷卻到室溫，過濾出不溶物，即得左旋亮氨酸即L-亮氨酸，并保留濾液；第三步：第二步所得濾液在堿性條件下繼續水解，結束后用稀酸中和，過濾得右旋亮氨酸即D-亮氨酸。拆分所用溶劑是水，生產成本低，對環境污染小；制備工藝簡單、處理提純方便、設備要求不高。
【專利說明】一種拆分外消旋亮氨酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明是一種手性有機化合物的制備技術，尤其是一種拆分外消旋亮氨酸的方法。
【背景技術】
[0002]L-亮氨酸在營養學上，屬于人體的必需氨基酸。L-亮氨酸可用作營養增補劑，如用于配制氨基酸輸液及綜合氨基酸制劑，與其他氨基酸共同作用，修復肌肉，控制血糖，給身體組織供應能量。研究表明，亮氨酸能夠影響控制人體內能量平衡的機制[1];亮氨酸對人體耐疲勞性及控制肌肉和肝糖原降解有顯著作用[2];通過完成糖類的氧化提高機體的氧化能力且增加骨骼肌肉細胞中線粒體密度[3]。此外，亮氨酸還可用于調味增香劑。D-亮氨酸是一種非天然氨基酸，有助于激光穴位刺激鎮痛，有望作為提高激光穴位刺激鎮痛效應的輔助藥；和D-苯丙氨酸共同作用，得到的氨基酸復合制劑可作為治療馬疼痛良好的鎮痛藥[4]，包括對術前后的疼痛、風濕性關節炎、扭傷和過勞等引起的疼痛；亮氨酸衍生物能夠有效催化脂肪酮與醛的水相羥醛縮合反應[5];用亮氨酸制備合成的N-稀有脂肪酰-亮氨酸具有抗菌性能[6];衍生物N-酰基-D-亮氨酸可以用于手性拆分。
[0003]關于D-亮氨 酸的制備，文獻報道的方法主要有化學拆分法、酶法和誘導結晶法。
[0004]化學拆分相關，專利(一種拆分制備光活氨基酸的方法.CN102241555A) [7]中用具有光學活性的1-苯基乙磺酸和消旋的取代苯基乙磺酸組成的組合AES拆分劑，在水溶液中對DL-Leu進行拆分得到D-Leu，光學純度98.2%。而在乙腈/水比例為9:1的溶液中拆分時，濾餅在乙腈/水溶液里(9:1)溶解，滴加氨水至pH為5.98，得到D-Leu，光學純度99.6%。專利(一種外消旋氨基酸的拆分方法.CN101659623A)[8]以D-DBTA為拆分劑，得到 D-Leu,光學純度 98.8 %。文獻 The Resolution of Amino Acids.11.1soleucine,Alloisoleucine, Leucine and Norleucinet9]外消旋亮氨酸酸化得到N-酸基-DL-亮氨酸；產物與(_)-α -葑胺加入熱水中，反應得到復鹽；上述復鹽在甲醇中經過分級結晶提純得到N-酰基-D-亮氨酸.(-) - α -葑胺復鹽，后者分解得到N-酰基-D-亮氨酸，然后在3Ν鹽酸中回流，反應液濃縮，蒸干后，殘余物在甲醇中溶解，用氨水調PH至等電點，過濾得到濾餅為D-Leu。以上方法，有的拆分劑的價格比較高，有的中間產品不易于進行后處理，有的則反應步驟較多，操作過程相對復雜，不方便工業化生產。
[0005]專利(N-酰基-DL-Leu的制備及用途.CN102617384A)[10]中首先將L-Leu在有機酸中消旋，得到DL-Leu，外消旋亮氨酸在無機堿溶液中與乙酸酐等酰化試劑作用生成N-酰基-DL-Leu，將其溶于堿性溶液，加入D-氨基酰化酶，經酶水解，中和，分離，提純得到D-Leu0此法，反應條件溫和，工藝簡潔；但是D-氨基酰化酶較不易獲得，價格比較高，反應體系中L-Leu不容易回收。
[0006]文獻Optical Resolution of DL-Amino Acids by PreferentialCrystallization Procedure[n],將DL-Leu和苯橫酸制成DL-Leu ?苯橫酸鹽。將DL-Leu ?苯磺酸鹽在水中溶解，加入少量D-Leu-BS做晶種，析出D-Leu.苯磺酸鹽，用離子交換法分出苯磺酸，即得D-Leu。誘導結晶法制取D-亮氨酸，延長了生產周期，增加了生產成本，而且產物的光學純度相對較低，不適合工業生產。因此，有必要研究新的拆分方法。

【發明內容】

[0007]技術問題:本發明的目的是提供一種酶法拆分DL-亮氨酸制備L-亮氨酸和D-亮氨酸的方法，該方法拆分DL-亮氨酸對環境污染小、工藝簡潔、所得產品光學純度高而且收率較高。
[0008]技術方案:本發明的拆分外消旋亮氨酸的方法以酶法拆分外消旋亮氨酸即DL-亮氨酸制備左旋亮氨酸和右旋亮氨酸，具體包括以下步驟:
[0009]第一步:以外消旋亮氨酸為原料，按照亞硫酰氯法制備DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽；
[0010]第二步:將DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽溶于堿性水溶液中，加入脂肪酶，在30~40°C溫度下酶催化水解5~10小時，再逐漸冷卻到室溫，過濾出不溶物，即得左旋亮氨酸即L-亮氨酸，并保留濾液；
[0011]第三步:第二步所得濾液在堿性條件下繼續水解，結束后用稀酸中和，過濾得右旋亮氨酸即D-亮氨酸。
[0012]所述的脂肪酶包 括:酸性脂肪酶、中性脂肪酶、堿性脂肪酶。
[0013]所述的稀酸包括稀鹽酸或稀硫酸，稀酸的濃度為0.1-2.0moI/Lο
[0014]所述第二步中的堿性水溶液所用的堿為:NaOH、KOH、NaHC03、Na2CO3或氨水。
[0015]所述第三步中堿性條件所需要的堿是LiOH、NaOH, KOH、K2CO3或Na2C03。
[0016]有益效果:本發明酶處理后的酯的溶液在堿水中比酰胺更容易水解；拆分所用溶劑是水，生產成本低，對環境污染小；制備工藝簡單、處理提純方便、設備要求不高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發明的工藝路線圖。
【具體實施方式】
[0018]本發明以酶法拆分DL-Leu制備左旋亮氨酸和右旋亮氨酸，首先以DL-Leu為原料，按照亞硫酰氯法制備DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽。然后將亮氨酸甲酯鹽酸鹽溶于堿性水溶液中，加入容易獲得廉價的脂肪酶，在一定溫度下酶催化水解一段時間，再逐漸冷卻到室溫，過濾出不溶物，即得左旋亮氨酸(L-亮氨酸)。母液在堿性條件下繼續水解，結束后用酸中和，過濾得右旋亮氨酸(D-亮氨酸)。這是首次使用脂肪酶選擇性水解亮氨酸酯制備光活亮氨酸的方法，與使用D-氨基酰化酶制備D-亮氨酸相比，脂肪酶來源更廣泛，價格更便宜，而且L-亮氨酸便于回收。
[0019]本發明中利用脂肪酶能夠選擇性催化對映體左旋亮氨酸甲酯的水解，得到左旋亮氨酸和右旋亮氨酸甲酯，由于左旋亮氨酸在溶液中溶解度較小，會從溶液中析出；而右旋亮氨酸甲酯在溶液中溶解度較大，則留在溶液中。平衡一段時間后，通過過濾可以將它們分開。
[0020]得到的右旋亮氨酸甲酯在堿性條件下進行水解反應，得到右旋亮氨酸鈉鹽。再經過稀強酸中和，生成亮氨酸。調節溶液的PH至亮氨酸的等電點，此時亮氨酸的溶解度最小，從溶液中析出，過濾即得到右旋亮氨酸。
[0021]2拆分條件
[0022]將DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽溶于一定量的飽和酶液中，并加入一定量的碳酸氫鈉，在30~40°C下攪拌5~10小時，再冷卻至室溫，濾出白色固體。白色固體為左旋亮氨酸。濾液中含有右旋亮氨酸甲酯，在NaOH等堿性條件下水解，再經過稀酸酸化，調節pH值，即得到光學純度較高D-亮氨酸。
[0023]實例1:
[0024]稱取3.62g(0.02mol)亮氨酸甲酯鹽酸鹽加入小錐形瓶中，再稱取
1.68g(0.02mol)碳酸氫鈉加入錐形瓶中，并量取16ml飽和脂肪酶溶液加入反應瓶中，將錐形瓶放入恒溫振蕩器內振蕩，設置反應溫度為38°C，反應8h，然后反應瓶緩慢冷卻降溫，真空抽濾。得到濾餅為L-亮氨酸1.02g,產率為77.86%，比旋光度[a ]D2° = +14.6° (C =2，6mol.T1HCl)。濾液中含有D-亮氨酸甲酯，往濾液中加入一定量的氫氧化鈉，溶解后再加入等體積的甲醇，于室溫下攪拌10h，用lmol.L-1稀鹽酸調節溶液的pH到6，再反應lh，過濾，用水洗滌濾餅，干燥得到D-亮氨酸0.90g，收率為68.70%, [a]D20 = -14.35° (C = 2，6mol.L 1HCl)。
[0025]實例2:
[0026]稱取3.6 2g亮氨酸甲酯鹽酸鹽加入小錐形瓶中，再稱取1.68g(0.02mol)碳酸氫鈉加入錐形瓶中，并量取16ml飽和脂肪酶溶液加入反應瓶中，將錐形瓶放入恒溫振蕩器內振蕩，反應溫度為34°C，反應時間為8h，然后反應瓶緩慢冷卻降溫，真空抽濾。得到濾餅為L-亮氨酸 0.92g，產率為 70.22%，比旋光度[a ]D2° =+14.6° (C = 2,6mol.T1HCD0 濾液中含有D-亮氨酸甲酯，往濾液中加入一定量的氫氧化鈉，溶解后再加入等體積的甲醇，于室溫下攪拌10h，用lmol.L-1稀鹽酸調節溶液的pH到6，再反應lh，過濾，用水洗滌濾餅，干燥得到 D-亮氨酸 0.94g，收率為 71.76%, [a ]D20 = -12.52。(C = 2，6mol.L^iHCI)。
[0027]實例3:
[0028]稱取3.62g亮氨酸甲酯鹽酸鹽加入小錐形瓶中，再稱取1.68g碳酸氫鈉加入錐形瓶中，并量取16ml飽和脂肪酶溶液加入反應瓶中，將錐形瓶放入恒溫振蕩器內振蕩，設置反應溫度為38°C，反應9小時，然后反應瓶緩慢冷卻降溫，真空抽濾。得到濾餅為L-亮氨酸1.19g，比旋光度[a]D2° =+14.6° (C = 2,6mol.T1HCD0濾液中含有D-亮氨酸甲酯，向濾液中加入固體氫氧化鈉，溶解后再加入甲醇，連續攪拌10h，用lmol.L—1稀鹽酸調節溶液的PH到6，再反應lh，過濾，用水洗滌濾餅，干燥得到D-亮氨酸0.83g，收率為63.36%,[a ]D20 = -14.40° (C = 2，6mol.T1HCl)。
【權利要求】
1.一種拆分外消旋亮氨酸的方法，其特征在于:該方法以酶法拆分外消旋亮氨酸即DL-亮氨酸制備左旋亮氨酸和右旋亮氨酸，具體包括以下步驟: 第一步:以外消旋亮氨酸為原料，按照已知的亞硫酰氯法制備DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽； 第二步:將DL-亮氨酸甲酯鹽酸鹽溶于堿性水溶液中，加入脂肪酶，在30~40°C溫度下酶催化水解5~10小時，再逐漸冷卻到室溫，過濾出不溶物，即得左旋亮氨酸即L-亮氨酸，并保留濾液； 第三步:第二步所得濾液在堿性條件下繼續水解，結束后用稀酸中和，過濾得右旋亮氨酸即D-亮氨酸。
2.根據權利要求1所述的一種拆分外消旋亮氨酸的方法，其特征在于所述的脂肪酶包括:酸性脂肪酶、中性脂肪酶、堿性脂肪酶。
3.根據權利要求1所述的一種拆分外消旋亮氨酸的方法，其特征在于所述的稀酸包括稀鹽酸或稀硫酸，稀酸的濃度為0.1-2.0moI/Lο
4.根據權利要求1所述的一種拆分外消旋亮氨酸的方法，其特征在于所述第二步中的堿性水溶液所用的堿為:NaOH、KOH、NaHC03、Na2CO3或氨水。
5.根據權利要求1所述的一種拆分外消旋亮氨酸的方法，其特征在于所述第三步中堿性條件所需要的堿是Li OH、NaOH, KOH、K2CO3或Na2CO3。
【文檔編號】C12P13/06GK103981248SQ201410167153
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】蔣立建, 付倩倩, 何慧, 唐賽杰, 顧美萍 申請人:東南大學