一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明適用于生物【技術領域】，提供了一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法及應用，該方法包括以下步驟：設計用于擴增VDR基因Cdx-2多態性位點片段的PCR引物，并通過突變PCR引物近3’端的一個堿基形成特異性PCR引物，所述特異性PCR引物的突變堿基與Cdx-2多態性位點的G等位基因堿基形成能被BseMII內切酶識別的酶切位點；使用上述特異性PCR引物擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段得到PCR擴增產物；使用BseMII內切酶對上述擴增產物進行酶切反應得到酶切產物；對所述酶切產物進行電泳、并分析電泳結果。本發明提供的新的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，操作簡單、且準確性高。
【專利說明】—種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，尤其涉及一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法及應用。
【背景技術】
[0002]維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)是介導活性維生素D— 1，25 (OH) 2D發揮生物效應的生物大分子，位于細胞膜或細胞核中。1，25 (OH)2D激素信號分子在靶細胞與VDR結合形成激素-受體復合物，該復合物作用于靶基因上的特定DNA序列，對結構基因的表達產生調節作用。因此，1，25 (OH) 2D在維持機體鈣-磷代謝，調節細胞增殖、分化等方面的重要作用是通過VDR介導實現的。
[0003]VDR基因上存在眾多單核苷酸多態性位點(Single NucleotidePolymorphisms, SNPs),它們廣泛分布于基因啟動子、外顯子和內含子等區域。這其中的一些SNPs可能通過各種機制影響VDR基因表達或蛋白質活性水平，從而影響到機體健康狀況。
[0004]Rsl 1568820[美國生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)的SNPs編號]是位于VDR基因啟動子上的一個SNP，并處于尾型同源盒轉錄因子_2 (Caudal Type Homeobox Transcription Factor2, CDX-2,為一種小腸特異性同源盒轉錄因子)與VDR啟動子結合的區域，故通常也叫Cdx-2位點。該位點多數情況下的等位基因為G，少數情況下為A。 VDR上Cdx-2位點的A等位基因可促進⑶X_2調節VDR啟動子的活性而提高VDR基因轉錄，促進小腸鈣吸收。AA基因型能降低骨質疏松、骨質疏松性骨折、原發性侏儒癥的發病風險，而系統分析發現該位點AA基因型與腫瘤風險增加有關。因此，檢測Cdx-2位點的基因型，對研究VDR相關的生物醫學作用具有重要價值。
[0005]在眾多分析SNP的實驗技術中，聚合酶鏈式反應(Polymerase ChainReaction, PCR)后的限制性酶切片段長度多態性(Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP)分析(PCR-RFLP)通常是最為簡單、有效的技術。但在目前知道的全部限制性內切酶中，僅有Bst4CI (或其同切口限制性內切酶HpyCH4II1、Tsp4C1、TaaI)能夠識別VDR基因Cdx-2位點所在的核苷酸序列(ACN'GT)，這類內切酶較不常用，且缺乏PCR擴增該目的片段的理想引物。同時，也尚未見到通過引物堿基替換引入其它酶切位點而實現分析的報道。因此，此前的研究者通過測序、探針雜交或高分辨率熔解曲線法(HighResolution Melting, HRM)分析等方法來檢測該位點的基因型。
[0006]1.測序法。該技術是分析核苷酸(或堿基)種類及排列順序的直觀方法，需要PCR儀和測序儀等。通過PCR反應擴增含有VDR基因Cdx-2位點的核酸片段，再用測序儀判讀該片段中依次排列的全部核苷酸種類，從測序報告中直接判定該DNA片段中Cdx-2位點的等位基因喊基。因測序原理的不同，可有不同的測序設備可選。如Illumina、AB1、LifeTechnology.Roche等等公司均有自己的品牌測序儀。這些測序設備通常含配套檢測試劑，如ABI3100/3700系列的核酸序列檢測儀，可結合ABI PRISM SNaPShot Multiplex試劑盒使用。測序設備價格相對較貴，大都在100萬元以上，配套試劑也較為封閉。這類方法大致分析流程是:特異性引物擴增含SNPs目的片段的PCR反應一PCR產物純化一純化產物為模版的再次PCR擴增(如用特殊試劑盒ABI SNaPshot)—純化PCR產物一測序一軟件分析。
[0007]2.探針技術法。主要是使用TaqMan探針，針對含有Cdx-2位點的VDR基因片段設計一對特異性引物，同時，設計兩種分別帶有不同熒光染料的特異性探針。TaqMan探針是在探針5'-端標記熒光染料，3'-端標記熒光淬滅劑，抑制同一條探針5'-端熒光染料的熒光信號；但當探針斷裂或分解后，位于探針兩端的熒光基團和猝滅基團分離，前者發出的熒光信號可被檢測，從而反映出某反應體系中是否具有能與該探針特異性結合的目的基因片段。這一方法的實現，需在實時熒光定量PCR儀上設定運行特定的溫控反應程序。在目的DNA片段變性-退火階段，完全匹配的探針會特異性地結合到互補的Cdx-2等位基因片段上；擴增目的片段的階段，特異性結合的探針會被復制延伸DNA模版的聚合酶從5'-端外切下來，發生探針分解、斷裂，通過檢測該探針所帶的特定熒光信號，判斷探針所對應的某一基因型。同理，如果另一熒光染料被檢測到，說明待測DNA片段是該熒光探針所對應的另一基因型。
[0008]3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting，HRM)。該方法依賴于高精度PCR儀(如LightScanner> Roche480II等設備)和飽和染料(如LC Green)。目的基因片段在含特異性引物等PCR反應體系中經過變性-退火-延伸反應后，飽和染料插入到擴增的目的DNA雙鏈中后，發出特定波長的熒光信號；而在熔解反應階段，雙鏈DNA會解開成為單鏈并釋放出飽和染料，熒光信號出現降低和消失的過程。熒光信號在整個過程中的強弱變化過程被儀器檢測記錄，生成熔解曲線。由于目的DNA片段不同基因型中的GC含量以及堿基互補性存在差異，該熔解曲線的峰值溫度和峰形會有所差異，其分辨精度可以達到對單個堿基差異的區分，即能分辨Cdx-2的C/G基因型。
[0009]測序、探針雜 交或高分辨率溶解曲線分析等方法均依賴于昂貴的儀器和試劑，以及較高的實驗操作技術。

【發明內容】

[0010]本發明的目的在于提供一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法及應用，旨在解決由于針對VDR的Cdx-2多態性位點擴增設計引物難度極大、導致無法通過常規的PCR-RFLP的方式，簡單、準確地進行VDR基因多態性位點Cdx_2分析的問題。
[0011]本發明是這樣實現的，一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，包括以下步驟:
[0012]設計用于擴增VDR基因Cdx-2多態性位點片段的PCR引物，并通過突變PCR引物近3’端的一個堿基形成特異性PCR引物，所述特異性PCR引物的突變堿基與Cdx-2多態性位點的G等位基因堿基形成能被BseMII內切酶識別的酶切位點；
[0013]使用上述特異性PCR弓丨物擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段得到PCR擴增產物；
[0014]使用BseMII內切酶對上述擴增產物進行酶切反應得到酶切產物；
[0015]對所述酶切產物進行電泳、并分析電泳結果。
[0016]以及，一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法在肥胖流行病學研究領域中的應用。[0017]本發明提供的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，通過在用于擴增VDR基因Cdx-2多態性位點片段的PCR引物近3’端人為突變一個堿基，從而使得該突變堿基與Cdx-2多態性位點的G等位基因堿基形成能被BseMII內切酶識別的酶切位點，使得BseMII內切酶能選擇性的對擴增產物的酶切位點進行酶切反應，從而達到分析所述VDR基因多態性位點Cdx-2的基因型的目的。該方法不僅操作簡單便捷、成本低廉，且準確度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發明實施例提供的PCR擴增產物示意圖；
[0019]圖2是本發明實施例提供的VDR基因Cdx-2位點的RFLP電泳分析結果圖；
[0020]圖3是本發明實施例提供的VDR基因Cdx-2位點三種基因型的測序結果圖。
【具體實施方式】
[0021]為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0022]本發明實施例提供了一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，包括以下步驟:
[0023]SO1.設計用 于擴增VDR基因Cdx_2多態性位點片段的PCR引物，并通過突變PCR弓丨物近3’端的一個堿基形成特異性PCR引物，所述特異性PCR引物的突變堿基與Cdx-2多態性位點的G等位基因堿基形成能被BseMII內切酶識別的酶切位點；
[0024]S02.使用上述特異性PCR弓丨物擴增Cdx_2多態性位點的DNA片段得到PCR擴增產物；
[0025]S03.使用BseMII內切酶對上述擴增產物進行酶切反應得到酶切產物；
[0026]S04.對所述酶切產物進行電泳、并分析電泳結果。
[0027]具體地，上述步驟SOl中，發明人通過NCBI網站下載得到VDR基因序列(GeneID:7421,NCBI Reference Sequence:NG_008731.1)，并從 SNP 數據庫查得 rsl 1568820 序列如下，對應 SED ID NO:3, SED ID NO:4，具體為 rsll568820[Homo sapiens]:
[0028]ATATTCCTGAGTAAACTAGGTCACA [A/G] TAAAAACTTATTTCTTATTATGG GT，其中上述序列中的[A/G]分別代表Cdx-2多態性位點的兩種不同基因型A或G。
[0029]發明人利用Primer Premier和NEBcutter等生物學軟件的限制性內切酶位點搜索功能，截取該SNP兩側約400bp共800bp的堿基長度，尋找酶切位點，僅找到Bst4CI (HpyCH4II1、Tsp4C1、TaaI)這種識別ACN'GT序列的內切酶可用于鑒定Cdx_2位點基因型。但在VDR的Cdx-2位點兩側距離最近的上游312bp處和下游51bp處還各有一個Bst4CI識別位點，為方便以下進行描述，分別將Cdx-2位點上下游的這2處Bst4CI識別位點表示為Bst4C1-312、和Bst4CI+51。因此，理論上可以在Bst4CI_312—Cdx_2位點之間設計上游引物，Cdx-2—Bst4CI+51之間設計下游引物，從而擴增出只含一個Bst4CI內切酶識別的Cdx-2位點。但對Cdx-2—Bst4CI+51之間的核苷酸序列分析發現:由于該狹窄區域的GC含量很低，僅為21.5%，要想在這個50bp的區域設計出理想的引物十分困難，并隨之會增加實驗條件摸索的難度與成本。因此，Bst4CI內切酶鑒定VDR Cdx-2基因型的路線無法實現。
[0030]此外，發明人還嘗試通過截取VDR Cdx-2位點兩側約50bp共IOObp的堿基長度，利用SiteFind在線軟件搜索該位點附近可經引物近3'-端突變1_2個堿基而形成鑒別該位點的限制性內切酶，仍無合適結果。
[0031]經過發明人對Cdx-2多態性位點序列反復研究發現，設計用于擴增VDR基因Cdx-2多態性位點片段的PCR引物時，Cdx-2多態性位點附近的序列可以通過PCR引物近3'端突變I個堿基形成特異性PCR引物，具體地，PCR引物近3'端的一個堿基A突變為堿基T，突變后的特異性PCR引物的突變堿基與Cdx-2多態性位點的G等位基因堿基構成能被SiteFind在線軟件的候選內切酶庫中并不含有、本領域技術人員不會想到的BseMIl(BspCNI)內切酶識別的酶切位點，所述BseMII (BspCNI)內切酶識別序列為5-CTCAG (N) 1(|丨_3或
3-GAGTC(N)8 ? -5。向SiteFind軟件的內切酶庫添加BseMII后，發現在Cdx-2多態性位點附近突變I個堿基后，擴增產物將含有能被能BseMII內切酶識別的酶切位點。
[0032]作為優選實施例，為在VDR Cdx-2多態性位點附近構建BseMII識別序列來鑒定Cdx-2基因型，所述特異性PCR引物的序列如SED ID NO: 1、SED ID N0:2所示，其上游引物用Cdx-2F表示，下游引物用Cdx-2B表示，所述Cdx-2F、Cdx-2B的序列為:
[0033]Cdx-2F:TTATATATATTCCTGAGTAAACTAGGTCTCA ；
[0034]Cdx-2B: GCGTGGAGTTAGAAAGACAGAAG?
[0035]其中Cdx_2F近3’端第三個堿基T為突變堿基，上述引物Cdx_2F、Cdx_2B經引物評價軟件分析，此對引物的Tm值為58°C,具評分結果較好，以Primer Premier5.0評測結果為例，其Rating值達到了 84。所述引物Cdx_2F、Cdx_2B適宜的Tm值(55_65°C為宜)、良好的引物評分，適合所述Cdx-2多態性位點DNA片段的擴增；且若PCR產物能被BseMII酶切，即可獲得水平凝膠電泳能夠分辨的適宜的酶切片段長度:282bp和42bp。
[0036]上述步驟S02中，使用上述特異性PCR引物擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段，可以得到含有BseMII內切酶識別位點的PCR擴增產物；由于特異性PCR上游引物近3’端、與Cdx-2多態性位點相距兩個堿基的位置含有人為替代的堿基T，從而使得當Cdx-2多態性位點基因型為G時，PCR擴增產物中含有能被BseMII內切酶識別的位點5’ -CTCAG(N) 1(|_3’，因此PCR擴增產物能被BseMII內切酶酶切，分別得到不同長度的酶切片段；而當Cdx_2多態性位點基因型為A時，此時，與BseMII內切酶識別位點對應的PCR擴增產物序列為5’ -CTCAA(N) 1(|-3’，因此，其仍然不能被BseMII內切酶酶切，酶切后的PCR產物的長度仍然保持不變。作為具體實施例，當特異性PCR引物的序列為:
[0037]Cdx-2F:TTATATATATTCCTGAGTAAACTAGGTCTCA ；
[0038]Cdx-2B:GCGTGGAGTTAGAAAGACAGAAG 時，所述 PCR 擴增產物如圖1 所示，其中，Cdx-2多態性位點A基因型的PCR擴增產物序列如SED ID NO: 5所示，Cdx_2多態性位點G基因型的PCR擴增產物序列如SED ID N0:6所示。當Cdx_2多態性位點基因型為G時，經酶切后將得到長度為282bp和42bp的酶切片段；而當Cdx-2多態性位點基因型為A時，此時，與BseMII內切酶識別位點對應的PCR擴增產物序列為5-CTCAA (N) 1(|_3’，因此，其仍然不能被BseMII內切酶酶切，酶切后的PCR產物的長度仍然保持不變，為324bp。
[0039] 上述用于擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段可以直接從生物樣品中提取得到，當然，也可以通過其他獲得該DNA片段的途徑獲取得到。[0040]作為優選實施例，所述步驟S02中，所述使用特異性PCR引物擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段的PCR擴增體系為:
[0041]
[0042]
【權利要求】
1.一種分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，包括以下步驟: 設計用于擴增VDR基因Cdx-2多態性位點片段的PCR引物，并通過突變PCR引物近3’端的一個堿基形成特異性PCR引物，所述特異性PCR引物的突變堿基與Cdx-2多態性位點的G等位基因堿基形成能被BseMII內切酶識別的酶切位點； 使用上述特異性PCR引物擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段得到PCR擴增產物； 使用BseMII內切酶對上述擴增產物進行酶切反應得到酶切產物； 對所述酶切產物進行電泳、并分析電泳結果。
2.如權利要求1所述的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，其特征在于，所述特異性PCR引物的上游引物用Cdx-2F表示，下游引物用Cdx-2B表示，所述Cdx-2F、Cdx_2B的序列分別如SED ID NO: 1、SED ID N0:2所示，具體為:
Cdx-2F:TTATATATATTCCTGAGTAAACTAGGTCTCA ；
Cdx-2B:GCGTGGAGTTAGAAAGACAGAAG, 其中Cdx-2F近3’端第三個堿基T為突變堿基。
3.如權利要求1所述的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，其特征在于，所述使用特異性PCR引物擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段得到PCR擴增產物的步驟中，PCR擴增體系為:
4.如權利要求1~3任一所述的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，其特征在于，所述使用特異性PCR引物擴增Cdx-2多態性位點的DNA片段得到PCR擴增產物的步驟中，PCR擴增體系為:
5.如權利要求1~3任一所述的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，其特征在于，在所述使用BseMII內切酶對上述擴增產物進行酶切反應的步驟中，所述酶切反應的反應體系如下:
6.如權利要求1~3任一所述的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，其特征在于，在所述使用BseMII內切酶對上述擴增產物進行酶切反應的步驟中，所述酶切反應的反應體系如下:
7.如權利要求1~3任一所述的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法，其特征在于，所述電泳的條件為使用2%的瓊脂糖凝膠、以TBE為電泳緩沖液，在120V穩壓條件下，電泳40min.
8.如權利要求1~7任一所述的分析VDR基因多態性位點Cdx-2的方法在肥胖流行病學研究領域中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952486SQ201410168692
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】周繼昌, 朱玉梅, 劉小立, 楊應周, 楊慧, 郭平, 徐健, 車曉玲 申請人:深圳市慢性病防治中心