一種煙草NtGt1a基因單堿基替換突變的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種煙草NtGt1a基因單堿基替換突變的檢測方法，以煙草突變群體的DNA序列為模板，設計NtGt1a基因特異性引物，通過PCR儀進行擴增，擴增后PCR產物首先高溫變性，緩慢降低溫度復性，然后利用限制性內切酶CELI進行酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，對酶切后產生3條電泳帶的最高分子量電泳條帶進行測序，將測序結果與NCBI發布的NtGt1a序列進行比對，確定發生突變的類型，本發明的檢測方法具有準確快速，易操作，重復性高，通量大的優點。
【專利說明】-種煙草NtGtla基因單堿基替換突變的檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種煙草NtGtla基因單堿基替換突變的檢 測方法。

【背景技術】
[0002] 生物基因組DNA序列的變異是物種遺傳多樣性的物質基礎，是生物多樣性的基本 變異來源。單堿基替換突變指的是DNA分子中，一堿基對被另一堿基對所替換的現象，包 括轉換和顛換兩種方式，是DNA序列中最常見的的變異。當前，在煙草遺傳育種中，使用分 子標記的新型育種技術是提高育種工作效率和加快獲得優良品系的有效方法。應用分子標 記育種首先需要在DNA水平上篩選到與煙草經濟性狀密切相關的遺傳標記，例如與多葉性 狀，抗旱性，抗病性等性狀相連鎖的基因。其次是建立篩查基因多態性的檢測平臺，最終實 現分子標記輔助育種的最終目的。
[0003] 近年來，DNA單堿基多態性（SNP)檢測方法的發展是日新月異。主要包括以測序為 基礎的方法，基于分子雜交的方法，以及利用堿基突變引起的DNA片段差異作為SNP檢測靶 標的方法。以測序為基礎的方法是分析SNP的黃金標準，既能發現已知的SNP，也能檢測到 未知的SNP。但是需要大規模的提取基因組，構建測序文庫，上機測序。最后需要專業的技 術人員應用運算能力強大的計算機對測序結果分析。此方法步驟多而且分散，實驗試劑昂 貴，工作量大，不適宜大群體的檢測。而基于分子的方法需要短的核苷酸探針在和互補的目 的片段進行雜交時，在完全匹配和有錯配兩種情況下，根據雜交復合體穩定性的不同而將 SNPs位點檢測出來。此方法價格昂貴，不是通用的方法，對于一般的分子實驗室實用性不 大。利用堿基突變引起的DNA片段差異作為SNP檢測靶標的方法的主要步驟是利用PCR擴 增遺傳群體或突變群體中不同個體的某一 DNA片段，再使用限制性內切酶對擴增的DNA片 段進行酶切，產生不同類型的電泳圖譜，最后對產生不同類型電泳圖譜的DNA片段進行測 序，與原來序列進行比對分析，從而確定堿基突變的位置。此方法具有準確快速，易操作，重 復性高，通量大的優點。


【發明內容】

[0004] 本發明解決的問題是目前DNA單堿基多態性（SNP)檢測方法步驟多而且分散，實 驗試劑昂貴，工作量大，不適宜大群體的檢測，本發明在于提供一種煙草NtGtla基因單堿 基替換突變的檢測方法，本方法具有準確快速，易操作，重復性高，通量大，有益于推廣。
[0005] 本發明采用的技術方案，包括以下步驟：以煙草突變群體的DNA序列為模板，設計 NtGtla基因特異性引物，通過PCR儀進行擴增，擴增后PCR產物首先高溫變性，緩慢降低 溫度復性，然后利用限制性內切酶CELI進行酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測， 其中未發生突變的樣品為1條電泳帶，發生突變的樣品為3條電泳帶，對酶切后產生3條 電泳帶的最高分子量電泳條帶進行測序，利用生物信息學方法，將測序結果與NCBI發布的 NtGtla序列進行比對，確定發生突變的類型，所述的煙草NtGtla基因特異性引物為： 上游引物NtGtla-F: 5' - CAACCTGAGACCTCTGTTAGTATG -3' 24bp 下游引物NtGtla-R: 5' - CCTTCTAATAACGCTGCTCTACT -3' 23bp 。
[0006] 所述的PCR反應體系為：PCR反應體系體積為20 μ L，體系包含14. 9 μ L ddH20， 2 μ L 10 倍 PCR 緩沖液，L 6 μ L dNTPs (10mM)，上游引物 NtGtla-F (λ 2 μ L，下游引物 NtGtla-R 0· 2 μ L (10 μ Μ )，ExTaq 酶為 0· 1 μ L ; 所述的PCR反應條件：預變性94°C 5min，40個擴增循環（94°C 30 s，58°C 30 s，72°C 30s)延伸72°C 10 min，然后95°C 10 min迅速變性，72°C 20s，每個循環降低0. 3°C直至 20°C，最終緩慢變性，形成錯配雜合雙鏈。
[0007] 所述的酶切是在PCR產物中加入從芹菜中提取出的CELI酶進行酶切，酶切體系 為 4.5yL ddH20，1.5yL 10倍 PCR緩沖液，lyL CELI，8yLPCR 產物，酶切條件是在 42°C 下酶切30分鐘。
[0008] 所述的PCR產物酶切的瓊脂糖凝膠濃度為3%。
[0009] 本發明達到的技術效果：本發明的技術方法在于采用一種煙草NtGtla單基因堿 基突變檢測方法的應用，可用于煙草分子標記輔助育種，通過將不同的突變位點與煙草的 不同性狀進行關聯分析，確定基因點突變與性狀的對應關系，最終達到煙草的良種選育。
[0010] 本發明能夠準確快速檢測突變群體中NtGtla的單堿基突變，研究表明DNA序列中 單堿基突變會造成較大的遺傳效應，引起較大的表型性狀改變，所以本發明在分子育種和 遺傳多樣性評價等方面的研究具有廣大的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1 :本發明實施例1中煙草NtGtla基因第1外顯子區域1172bp PCR產物經CELI 酶切前的3%瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】 [0012]
[0013] 下面結合【專利附圖】

【附圖說明】對本發明煙草NtGtla基因單堿基替換突變的檢測方法做進一 步詳細描述。本發明的實施例是為了更清楚的說明本發明，以使公眾對
【發明內容】
從整體上 得到充分的理解，而非對本發明保護范圍的限定。
[0014] 實施例1 (一）CELI核酸酶粗提物的獲得 1、 取500g生殖生長期的泰國黃芯芹菜葉片，用冷的ddH20仔細清洗，然后擦干葉片上 的水滴，放入榨汁機后得到的勻漿經濾紙過濾備用， 2、 將獲得的芹菜汁放入離心機；3100rpm離心20分鐘，將上清轉入新離心管， 3、 在上清液中加入Tris和PMSF，使其終濃度分別為0. 1 M Tris-HCl，pH 7. 7和100 μ M PMSF。向上清液中加入硫酸銨，溶液終濃度為25%， 4、 每升上清液需加入144g硫酸銨，攪拌30分鐘，9000rpm離心50分鐘，收集上清，再 加入固體硫酸銨，使上清液中硫酸銨最后濃度達到80%，緩慢攪拌30 min后9000rpm離心 70分鐘，輕輕倒棄上清溶液，保留沉淀， 5、 將上一步獲得的沉淀重懸于1/10初始體積的0. 1 M Tris-HCl pH 7. 7，0. 5 M KC1 和100 μ M PMSF緩沖液中，確保全部沉淀都溶解， 6、把重懸的蛋白溶液加入到透析袋（cutoff: lOOOODa)中置于Tris-HCl pH 7. 7，0. 5 M KC1和100 μ M PMSF透析緩沖液中進行透析，每小時換一次透析緩沖液，8小時透析結束 后，將透析袋內的溶液倒入干凈的離心管，分裝后在_80°C保存備用。
[0015] (二）煙草基因組DNA提取 收集貴煙1號突變群體的煙草葉片樣品，_8〇°C保存。煙草基因組DNA提取過程具體步 驟如下： 1. 收集3g煙草葉片放于2ml離心管中，加入液氮，研磨成粉末狀； 2. 加入800 yL DNA提取緩沖液，振蕩器震蕩均勻，加入5 yL RNA酶（10mg/ml); 37 °C水浴鍋水浴30 min ; 3. 加入800 μ L苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1 )，震蕩混勻，12000 rpm，離心10 min， 吸取上清約650 μ L至一個新的2ml管； 4. 加入650 μ L氯仿，混合均勻，12000 rpm，離心10 min,吸取上清約450 μ L至一 個新的1.5 ml管； 5. 加入45 μ L 3M乙酸鈉 （pH = 4. 8)，450 μ L異丙醇；輕輕混勻，DNA析出，呈絮狀 沉淀，-20°C放置30 min; 12000 rpm，離心10 min;棄上清,70%酒精600 μ L清洗沉淀 物；12000 rpm，離心 10 min ; 6. 倒掉上清，通風櫥內干燥30 min; 7. 重懸在100 yLddH20中，輕輕吸打至溶解，-20°C保存。
[0016] (三）NanoDrop微量紫外分光光度計測定DNA濃度和純度 以100ng/ μ L作為標準DNA濃度，若測定的DNA濃度在90-110ng/ μ L之間，表明DNA濃 度符合實驗要求；濃度高于ll〇ng/μ L需要稀釋成標準濃度；濃度過低的需重新提取DNA。
[0017] (四）構建8倍DNA混合池 用NanoDrop微量紫外分光光度計測定1712個已提取的煙草DNA濃度，均一化處理，使 得煙草DNA濃度為100ng/ μ L，8個DNA樣品中各取5 μ L構建8倍DNA混合池。
[0018] (五）煙草NtGtla編碼序列的PCR擴增 1、引物設計 根據煙草NtGtla基因在NCBI數據庫上的基因序列（登錄號：AB052557. 1)，利用 PRMER 5設計煙草NtGtla基因特異性PCR引物，引物序列如下： 上游引物 NtGtla-F: 5' - CAACCTGAGACCTCTGTTAGTATG -3' 24bp 下游引物 NtGtla-R: 5' - CCTTCTAATAACGCTGCTCTACT -3' 23bp 該引物對擴增煙草NtGtla第1外顯子區域，片段大小為1172bp。
[0019] 2、PCR 擴增 (1) PCR反應體系如表1所示 表1 PCR反應體系

【權利要求】
1. 一種煙草NtGtla基因單堿基替換突變的檢測方法，其特征在于：以煙草突變群體的 DNA序列為模板，設計NtGtla基因特異性引物，通過PCR儀進行擴增，擴增后PCR產物首先 高溫變性，緩慢降低溫度復性，然后利用限制性內切酶CELI進行酶切，對酶切產物進行瓊 脂糖凝膠電泳檢測，對酶切后產生3條電泳帶的最高分子量電泳條帶進行測序，將測序結 果與NCBI發布的NtGtla序列進行比對，確定發生突變的類型，所述的煙草NtGtla基因特 異性引物為： 上游引物NtGtla-F: 5' - CAACCTGAGACCTCTGTTAGTATG -3' 24bp 下游引物NtGtla-R: 5' - CCTTCTAATAACGCTGCTCTACT -3' 23bp 。
2. 根據權利要求1所述的煙草NtGtla基因單堿基替換突變的檢測方法，其特征在于： 所述的PCR反應體系為：PCR反應體系體積為20 μ L，體系包含14. 9 μ L ddH20, 2 μ L 10倍 PCR緩沖液，1.6yL dNTPs，上游引物 NtGtla-F 0.2yL，下游引物 NtGtla-R 0.2yL，ExTaq 酶為0. lyL。
3. 根據權利要求1所述的煙草NtGtla基因單堿基替換突變的檢測方法，其特征在 于：所述的PCR反應條件：預變性94°C 5min，40個擴增循環：94°C 30 s，58°C 30 s，72°C 30s，延伸72°C 10 min，然后95°C 10 min迅速變性，72°C 20s，每個循環降低0. 3°C直至 20°C，最終緩慢變性，形成錯配雜合雙鏈。
4. 根據權利要求1所述的檢測煙草NtGtla基因單堿基突變的檢測方法，其特征在于： 利用限制性內切酶CELI進行酶切的具體條件為在PCR產物中加入從芹菜中提取出的CELI 酶進行酶切，酶切體系為4. 5yL ddH20，1.5yL 10倍PCR緩沖液，lyL CELI，8yLPCR產 物，酶切條件是在42°C下酶切30分鐘。
5. 根據權利要求1所述的檢測煙草NtGtla基因單堿基突變的檢測方法，其特征在于： 其特征在于，所述的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測的瓊脂糖凝膠濃度為3%。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232749SQ201410208059
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年5月18日 優先權日:2014年5月18日
【發明者】付強, 鄒頡, 陳洪 申請人:貴州省煙草科學研究院