一種基于輕烴氧化菌異常進行油氣勘探的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于輕烴氧化菌異常進行油氣勘探的方法，它是將土壤樣品均質(zhì)化處理后，提取樣品DNA，利用熒光定量PCR技術(shù)分別對其中的丙烷氧化菌和甲烷氧化菌定量；確定丙烷氧化菌和甲烷氧化菌異常下限，建立驗證區(qū)油氣微生物勘探的微生物異常參考體系，繪制丙烷氧化菌等值線后進行微生物異常分區(qū)；在異常分區(qū)內(nèi)根據(jù)甲烷氧化菌含量，將異常分區(qū)內(nèi)帶氣頂油藏和純油藏進行標示。本發(fā)明利用輕烴氧化菌異常進行油氣勘探，在檢測精度方面，直接測試樣品中輕烴氧化菌的數(shù)量，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法中的人為干擾，檢出量比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法高1～2個數(shù)量級，將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的14～21天縮短為12小時，且一次可以檢測96個樣品，有效提高了微生物油氣勘探的精度和檢測效率。
【專利說明】一種基于輕烴氧化菌異常進行油氣勘探的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種采用分子生物學技術(shù)，并應用于微生物油氣勘探，有效避免地表污染或近地表生物成因的油氣微生物勘探方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石油和天然氣是關(guān)乎國計民生的基礎能源。經(jīng)過多年的三維地震勘探，我國大多數(shù)易于發(fā)現(xiàn)的油氣藏資源已經(jīng)探明并開發(fā)。規(guī)模較小、非構(gòu)造型及隱蔽的油氣藏資源成為目前勘探的首要目標。但對這些油氣資源使用地震的手段勘探成本過高且數(shù)據(jù)分析困難。
[0003]油氣微生物勘探技術(shù)是近地表地球化學勘探技術(shù)的一個分支，具有直接、有效、成本低等特點。它可作為一種獨立技術(shù)，在沒有地質(zhì)或地震資料地區(qū)進行初勘，確定遠景區(qū)，進行油藏性質(zhì)和儲量評價；也可與三維地震和化學勘探相結(jié)合，更準確地確定井位，擴邊增儲，查明未發(fā)現(xiàn)的含油氣圈 閉及漏失的油氣藏，增加成功率，減少勘探成本及風險。
[0004]油氣微生物勘探的技術(shù)原理是:埋藏在地下深處的油氣藏，在各種動力作用下，油氣藏的輕烴氣(主要是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷)通過微滲漏持續(xù)向地表擴散和運移，土壤中的專性微生物以輕烴氣為其唯一能量來源，在油藏正上方的地表土壤中非常發(fā)育并形成微生物異常，通過檢測微生物異常可預測下伏油氣藏的存在。輕烴氣的微滲漏具有三個特點:一是垂向性，輕烴微滲漏時的運移方向總體上是垂直的，所以微生物異常的范圍大致對應于地下油氣藏的邊界，且微生物異常的強度與油氣藏的原始含量相對應；二是普遍性，即絕大多數(shù)油氣藏都存在輕烴氣的微滲漏，所以微生物檢測方法適用大部分油氣藏的勘探；三是動態(tài)性，即隨著油氣藏的不斷開發(fā)，輕烴微滲漏強度會相應降低，這種動態(tài)變化可以表征油氣田開發(fā)中剩余油氣的分布變化。
[0005]油氣微生物勘探技術(shù)于1937年由前蘇聯(lián)科學家創(chuàng)立，隨后，美國和德國開展了大量研究工作，近年印度也進行了相關(guān)研究。我國在該領(lǐng)域研究始于20世紀50年代中期，90年代后該技術(shù)重新得到重視。目前，得到廣泛應用的油氣微生物勘探技術(shù)主要是德國Wagner 博士研發(fā)的微生物油氣勘探(Microbial Prospection for Oil and Gas, MPOG)技術(shù)和美國Hitzman博士研發(fā)的微生物油氣調(diào)查(Microbial Oil Survey Technique,MOST)技術(shù)。這兩種技術(shù)對微生物檢測方法是培養(yǎng)法。主要涉及的指示性菌種包括甲烷氧化菌、乙烷氧化菌、丙烷氧化菌和丁烷氧化菌等。但據(jù)報道，土壤中99.7%以上的微生物都是不可培養(yǎng)的，所以培養(yǎng)法不能對自然環(huán)境中原生的相關(guān)輕烴氧化菌準確估值。且實驗室采用的培養(yǎng)條件也可能使原本很少的微生物數(shù)量被放大，出現(xiàn)假異常。此外，培養(yǎng)法操作繁瑣，勞動強度大，培養(yǎng)時間長(需要14~21天)，費時費力，不能滿足大批量樣品快速檢測要求。因此，如何提高油氣微生物勘探精度和效率一直是國內(nèi)外專家學者努力解決的問題。實時熒光定量PCR技術(shù)是一種新的分子生物學技術(shù)手段，它不需要培養(yǎng)，而是直接從樣品中提取細菌總DNA，檢測指示菌的功能基因含量，檢測結(jié)果包括可培養(yǎng)及不可培養(yǎng)的指示菌，較培養(yǎng)法更為準確、快捷(2~3小時即可檢測完畢)、高通量(I次可檢測96個樣品)。
[0006]實時熒光定量PCR技術(shù)作為核酸定量方法，在微生物生態(tài)學領(lǐng)域中得到了廣泛的應用，如用于環(huán)境中特定微生物群落變化的動態(tài)監(jiān)測，用于特定微生物群落生理代謝的研究以及環(huán)境微生物群落分布的研究。該技術(shù)在油氣微生物勘探中的應用亦有報道，如采用可培養(yǎng)技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)可分別檢測油田包氣帶剖面不同深度的甲烷氧化菌，研究結(jié)果顯示，采用實時熒光定量PCR技術(shù)甲烷氧化菌檢出量比可培養(yǎng)技術(shù)的甲烷氧化菌檢出量大I~2個數(shù)量級。
[0007]微生物油氣勘探需要重視指示菌種的選擇。甲烷氧化菌是一種專性菌，只能利用甲烷或甲基類化合物作為唯一碳源和能源。因為油氣藏向上運移的輕烴氣中甲烷含量較多，通過測定甲烷氧化菌可以確定地下油氣藏的存在。但由于非油氣區(qū)的同樣深度也能檢出相同量的生物成因甲烷，所以近地表土壤中的甲烷氧化菌不能專一的指示下部油氣藏微運移的甲烷，使得甲烷氧化菌作為油氣藏勘探出現(xiàn)假陽性的風險。丙烷也是微滲漏烴的重要組成成分，與甲烷來源的不確定性相比，丙烷唯一的來源是地下油氣藏。雖然其在輕烴氣中的含量不如甲烷，但由于持續(xù)向上運移，使得上覆土壤中的丙烷氧化菌大量積累，與土壤背景值相比，數(shù)量異常大，因而可通過檢測這種異常來推測油氣藏的存在。與甲烷氧化菌相t匕，丙烷氧化菌是油氣探測更可靠的指示菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對目前微生物油氣勘探中以甲烷氧化菌為主要指示菌，無法區(qū)分油氣藏滲漏甲烷或淺層生物成因甲烷，易產(chǎn)生“假陽性”結(jié)果的弊端，本發(fā)明提供一種基于熒光定量PCR技術(shù)，以檢測丙烷氧化菌含量異常為主，甲烷氧化菌含量異常為輔的新型微生物油氣勘探方法。
[0009]為實現(xiàn)本發(fā)明目的，這種基于輕烴氧化菌異常進行油氣勘探的方法，其特征在于包括以下步驟:
a.在油田開發(fā)區(qū)域或未開發(fā)區(qū)域內(nèi)土壤取樣，土壤取樣點密度為100mXlOO m~1000mXlOOO m，取樣深度為20 cm~250 cm，取樣量為200 g~500 g ；
b.將上述取樣點獲取的土壤樣品經(jīng)均質(zhì)化處理后提取樣品DNA，對其中的丙烷氧化菌和甲烷氧化菌數(shù)量進行實時熒光定量PCR測定；其中利用丙烷單加氧酶prmA基因數(shù)值代表丙烷氧化菌數(shù)量，利用甲烷單加氧酶pmoA數(shù)值代表甲烷氧化菌數(shù)量；
c.背景值的確定:采用迭代法剔除高值后，再參考長剖面法確定迭代次數(shù)，當新數(shù)據(jù)集的平均值與長剖面法確定的背景值相近時停止迭代，將新數(shù)據(jù)集的平均值X作為背景值，由此確定的新數(shù)據(jù)集的平均值和標準偏差為:甲烷氧化菌:x=33 copies/mg, SD=26.11 ;丙燒氧化菌:X=27 copies/mg, SD=13.71 ；
d.將上述背景值加上2倍新數(shù)據(jù)集的標準偏差SD為異常下限C。，確定甲烷氧化菌和丙烷氧化菌異常下限，確定驗證區(qū)甲烷氧化菌和丙烷氧化菌最大值，再將大于異常下限的數(shù)據(jù)進一步劃分異常等級后，建立驗證區(qū)油氣微生物勘探的微生物異常參考體系；
e.根據(jù)上述驗證區(qū)土壤取樣點密度取樣丙烷氧化菌檢測結(jié)果，繪制等值線，并按上述參考體系進行微生物異常分區(qū)；
f.在微生物異常分區(qū)內(nèi)，根據(jù)甲烷氧化菌含量，將異常分區(qū)內(nèi)帶氣頂油藏和純油藏進行標示。
[0010]本發(fā)明所使用的方法為提取采集土壤樣品的總DNA并通過實時熒光定量PCR技術(shù)對土壤樣品中的丙烷氧化菌和甲烷氧化菌分別定量，比對不同區(qū)域間的丙烷氧化菌含量，確定出丙烷氧化菌異常區(qū)域，在勘探區(qū)圖上標示出丙烷氧化菌含量分區(qū)圖，含量高的異常區(qū)為勘探靶區(qū)，隨后通過丙烷氧化菌與甲烷氧化菌含量對比，進一步識別油氣藏性質(zhì)。
[0011]本發(fā)明取得的技術(shù)進步:丙烷氧化菌異常只存在于油氣藏上方近地表土壤，若某一區(qū)域具有較高的丙烷氧化菌含量，則說明下部油氣藏的含量較高。所以以丙烷氧化菌含量異常來圈定油氣藏范圍較為準確，可減少甲烷氧化菌含量異常假陽性結(jié)果的風險。
[0012]本發(fā)明以油氣藏輕烴氣垂直運移理論為基礎，以微生物分子生物學技術(shù)為手段，設計丙烷氧化菌為主要指示菌，以甲烷氧化菌為輔助指示菌，減少了甲烷氧化菌結(jié)果假陽性的影響，可更加準確進行微生物油氣勘探工作。本發(fā)明利用基于DNA分析的輕烴氧化菌異常進行油氣勘探，以避免直接培養(yǎng)法存在的操作繁瑣、勞動強度大、培養(yǎng)時間長等缺陷，在檢測精度方面，直接測試樣品中輕烴氧化菌的數(shù)量，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法中的人為干擾，檢出量比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法高I~2個數(shù)量級，將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的14~21天縮短為12小時，且一次可以檢測96個樣品，有效提聞了微生物油氣勘探的精度和檢測效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明丙烷氧化菌異常分區(qū)示意圖。
[0014]圖2為圖1的異常A級區(qū)油藏性質(zhì)預測示意圖。
[0015]圖1、圖2中所示“+”為取樣點；“ ?”為采油井；“ ▲”為注水井；“ ”為帶氣頂油藏；“田”為純油藏。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明包括以下步驟:
a.在油田開發(fā)區(qū)域或未開發(fā)區(qū)域內(nèi)土壤取樣，土壤取樣點密度為100mXlOO m~1000mXlOOO m的網(wǎng)格取樣，取樣深度為20cm~250 cm，取樣量為200 g~500 g，本實施例采用250 mX250 m的網(wǎng)格取樣點密度，本實施例取樣深度50 cm；
b.將上述取樣點獲取的土壤樣品利用美國biospec公司生產(chǎn)的研磨珠均質(zhì)器均質(zhì)化處理后，采用美國mobio公司強力土壤DNA提取試劑盒進行DNA提取。
[0017]c.利用美國ABI公司生產(chǎn)的St印one熒光定量PCR儀對樣品中的丙烷單加氧酶prmA基因進行實時熒光定量PCR測定，測定數(shù)值可代表樣品丙烷氧化菌的數(shù)量。采用引物為 955F (5 ' -TGGCACCGGTGGATCTACGACGACT-3 ')和 1517R(5 ' -GCGCGATCAGCGTCTTGCCGTC-3 ')，以 Uncultured soil bacterium clone SLOl(JX045657.1)為標準品構(gòu)建標準曲線，20 μL的總反應體系為=SYBR'" Premix Ex Taq?(2X)10 μL、前端引物(10 μΜ) 0.2 μL、后端引物(10 μΜ )0.2 μL、ROX Reference Dye (50X)
0.4 μL、超純水7.2 μΙ,?ΝΑ模板2 μL，針對丙烷氧化菌功能基因prmA，進行熒光定量PCR擴增條件優(yōu)化，最終確定按如下擴增程序:94°C預變性30s，94°C 5s,66°C 30s,72°C 60s、88°C 15s (收集熒光信號)擴增40個循環(huán)，95°C 15s、60°C 60s、60°C~95°C每升高0.3°C讀數(shù)15s進行熔解曲線分析；
d.利用美國ABI公司生產(chǎn)的stepone熒光定量PCR儀對樣品中的甲烷單加氧酶pmoA基因進行實時熒光定量PCR測定，測定數(shù)值可代表樣品甲烷氧化菌的數(shù)量。在利用pmoA基因?qū)崿F(xiàn)對甲烷氧化菌的定量過程中，所采用的引物為A189f(5' -GGNGACTGGGACTTCTGG-3 ')和 ^6611^(5' -CCGGMGCAACGTCYTTACC-3 ')，以Uncultured bacterium clone F05-FW300-98 particulate pmoA gene (DQ917359.1)為標準品，20 μL 的總反應體系為:SYBR* Premix Ex Taq? (2X) 10 μL、前端引物(10 μΜ) 0.2μL、后端引物(10 μΜ )0.2 μL, ROX Reference Dye (50 X) 0.4 μL、超純水 7.2 μL、DNA模板2 μL，采用二步法進行，擴增程序:第一階段95°C預變性30s;第二階段95°C 5s、60°C30s,84°C 15s (收集熒光信號)擴增40個循環(huán)；第三階段繪制熔解曲線95°C 15s,60°C60s、60°C~95°C每升高0.3°C讀數(shù)，讀數(shù)時間15s進行熔解曲線分析；
e.背景值的確定:背景值的確定采用迭代法剔除高值后，再參考長剖面法確定迭代次數(shù)，當新數(shù)據(jù)集的平均值與長剖面法確定的背景值相近時，停止迭代，將新數(shù)據(jù)集的平均值X作為背景值，由此確定的新數(shù)據(jù)集的平均值和標準偏差如下:
甲燒氧化菌:X=33 copies/mg, SD=26.11
丙烷氧化菌:X=27 copies/mg, SD=13.71
據(jù)此，確定驗證區(qū)甲烷氧化菌和丙烷氧化菌功能基因背景值分別為33COpieS/mg和27copies/mg ；
f.背景值加上2倍新數(shù)據(jù)集的標準偏差SD為異常下限Ctl,據(jù)此，確定基于DNA分析的甲燒氧化菌和丙烷氧化菌異常下限分別為90 copies/mg和60 copies/mg,驗證區(qū)甲燒氧化菌和丙烷氧化菌最大值分別為2673 copies/mg和1589 copies/mg,將大于異常下限的數(shù)據(jù)進一步劃分異常等級，分別以200 copies/mg和500 copies/mg為界,確定為異常C級、異常B級和異常A級。由此建立驗證區(qū)基于DNA分析的油氣微生物勘探的微生物異常參考體系如表1所示，其中異常A級區(qū)為最有利勘探靶區(qū)。
[0018]表1基于DNA分析的油氣微生物異常參考體系
【權(quán)利要求】
1.一種基于輕烴氧化菌異常進行油氣勘探的方法，其特征在于包括以下步驟: a.在油田開發(fā)區(qū)域或未開發(fā)區(qū)域內(nèi)土壤取樣，土壤取樣點密度為100mXlOO m~1000mXlOOO m，取樣深度為20 cm~250 cm，取樣量為200 g~500 g ； b.將上述取樣點獲取的土壤樣品經(jīng)均質(zhì)化處理后提取樣品DNA，對其中的丙烷氧化菌和甲烷氧化菌數(shù)量進行實時熒光定量PCR測定；其中利用丙烷單加氧酶prmA基因數(shù)值代表丙烷氧化菌數(shù)量，利用甲烷單加氧酶pmoA數(shù)值代表甲烷氧化菌數(shù)量； c.背景值的確定:采用迭代法剔除高值后，再參考長剖面法確定迭代次數(shù)，當新數(shù)據(jù)集的平均值與長剖面法確定的背景值相近時停止迭代，將新數(shù)據(jù)集的平均值X作為背景值，由此確定的新數(shù)據(jù)集的平均值和標準偏差為:甲烷氧化菌:x=33 copies/mg, SD=26.11 ;丙燒氧化菌:X=27 copies/mg, SD=13.71 ； d.將上述背景值加上2倍新數(shù)據(jù)集的標準偏差SD為異常下限C。，確定甲烷氧化菌和丙烷氧化菌異常下限，確定驗證區(qū)甲烷氧化菌和丙烷氧化菌最大值，再將大于異常下限的數(shù)據(jù)進一步劃分異常等級后，建立驗證區(qū)油氣微生物勘探的微生物異常參考體系； e.根據(jù)上述驗證區(qū)土壤取樣點密度取樣丙烷氧化菌檢測結(jié)果，繪制等值線，并按上述參考體系進行微生物異常分區(qū)； f.在微生物異常分區(qū)內(nèi)，根據(jù)甲烷氧化菌含量，將異常分區(qū)內(nèi)帶氣頂油藏和純油藏進行標示。
【文檔編號】C12Q1/68GK103981277SQ201410249530
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】張翠云, 何 澤, 張勝, 寧卓, 殷密英, 劉雅慈 申請人:中國地質(zhì)科學院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所