一種茄鐮刀菌漆酶及其克隆和重組表達方法
【專利摘要】本發明公開了一種從茄鐮刀菌的菌株上所獲得的茄鐮刀菌漆酶，其相關蛋白基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，該茄鐮刀菌漆酶對應的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明所公開的漆酶在畢赤酵母中的重組表達比活力高，并且具有優良的熱耐受性與堿耐受性，能夠滿足造紙，漂白以及飼料生產等應用的要求。
【專利說明】一種茄鐮刀菌漆酶及其克隆和重組表達方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種新的從茄鐮刀菌上克隆的茄鐮刀菌漆酶的基因序列和表達蛋白，屬于生物工程領域。

【背景技術】
[0002]在造紙，紙漿，漂白以及飼料生產中，為了降低化學品導致的污染，生物酶制劑的應用越來越廣泛，在這之中漆酶的使用非常普遍，漆酶是一種結合多個銅原子的蛋白質，屬于銅藍氧化酶。漆酶作用底物相當廣泛，能夠對多種污染物如各種酚類染料、取代酚、氯酚、硫酚、雙酚、芳香胺等。漆酶是近年發現在造紙工業中最具潛力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能選擇性地催化木質素降解，不會產生有毒物質，并且生產在常溫、常壓的溫和條件下進行，節約設備和能耗。因此漆酶在造紙工業廢水處理等方面有著非常巨大的應用前景，但是已有的漆酶普遍存在比活力低，耐熱性，堿耐受性差等問題。


【發明內容】

[0003]針對現有技術的缺陷， 申請人:多年來嘗試篩選從菌株中尋找不同的蛋白酶以期獲得良好的降解木質素的能力，在大量篩選中 申請人:從一種爺鐮刀菌(Fusarium solanistrain)中克隆其核苷酸序列進行了克隆得到了一個完整的漆酶基因序列，基于該序列表達的漆酶具有高比活力，強的熱耐受性，堿耐受性等特點。
[0004]基于上述發現， 申請人:完成了本發明。本發明的技術方案是如下實現的:
[0005]本發明首先公開了一種茄鐮刀菌漆酶，其相關蛋白基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分別如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2所示。
[0006]上述茄鐮刀菌漆酶既可以通過人工合成相關基因序列得到(例如華大基因或其它生物基因合成單位均提供相關商業服務)，也可以通過克隆茄鐮刀菌來獲得，該漆酶基因的克隆方法具體包括下述步驟:
[0007]I)以木質素為唯一碳源培養茄鐮刀菌菌株，然后回收菌體，提取其總RNA并反轉錄得到cDNA ；
[0008]2)對所得cDNA進行擴增得到茄鐮刀菌菌株的漆酶基因部分序列進行測序。
[0009]在上述克隆方法中，所采用的克隆引物對如下所示:
[0010]Lac-FICAAGGGAACGACCATGCAYTDBCAYGG ；
[0011 ] Fus-RlCCACTTCGAAGTGCCAATCTANRTGRCARTGdIA。
[0012]在上述引物序列中，Y、R、B、D等代表兼并堿基，其所對應的可替換堿基序列采用本領域通用規則，即 R = A/G, Y = C/T, M = A/C, K = G/T, S = C/G, W = A/T, H = A/C/T, B=C/G/T，V = A/C/G，D = A/G/T, N = A/C/G/T ;其中的dl代表脫氧次黃嘌呤，從其功能上而言相當于N，擴增效果更好。
[0013]克隆測序后發現的新漆酶基因使用5’ RACE與3’ RACE得到其完整mRNA序列，該漆酶命名為lcc4。
[0014]最后， 申請人:深入研究了上述漆酶的重組表達方法，發現采用畢赤酵母作為載體具有較為理想的表達效力，具體的包括下述步驟:
[0015]I)使用Eco R1、Not I限制兩端帶有酶切位點的鐮刀菌漆酶基因以及pPIC9K，膠回收產物，T4連接酶連接，轉化到E.coli ToplO，鑒定轉化子，取陽性克隆進行測序；
[0016]2)將質粒DNA(克隆至pPIC9K的重組子)，用Sac I線性化質粒，沉淀并回收DNA ；
[0017]3)取畢赤酵母感受態細胞和線性化的質粒DNA混合均勻后電轉化，電轉化器完成后加入預冷的山梨醇溶液，將液體涂布MD平板，培養至白色的菌落長出；
[0018]4)影印轉化子至含有抗生素的YEro平板培養，挑取長勢良好的菌落到普通YEro平板上培養將其接種至BMGY液體培養基；5)培養后離心收集菌體，用BMMY液體培養基重懸菌體，將菌液放入另一無菌搖瓶中繼續培養并加入甲醇維持誘導。
[0019]在上述誘導完成后，離心取上清進行SDS-PAGE檢測即可。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發明漆酶在畢赤酵母中的重組表達過程示意圖。

【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022]爺鐮刀菌Fusarium solani strain,以木質素為唯一碳源進行培養,28°C震蕩培養5天然后回收菌體，提取其總RNA，使用oligo (dT) 18反轉錄得到cDNA，使用說明書公開的引物擴增(常規PCR條件即可)得到漆酶基因部分序列測序，隨后使用，5’RACE與3’RACE得到了漆酶基因的完整mRNA序列。在NCBI數據庫進行分析與比對，發現這個漆酶基因尚未被公開過，命名為lcc4。
[0023]根據 申請人:的研究，在序列表所示序列中，堿基序列的預測信號肽部分為ATGTACAAGACTCTATATTCACTCCTGCCTCTCGTCTTTGCTACCTCTATCAGCACC，對應的氨基酸序列中預測信號肽為 MYKTLYSLLPLVFATSIST。
[0024]實施例2
[0025]以下述方法測試漆酶的耐熱性:
[0026]在40_70°C下以10°C為級差測試上述漆酶的耐熱性，測試時間為60min，在5、10、20、30、6011^11這幾個時間點測試漆酶對48了5(2，2’氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸_6)銨鹽)的氧化。上述漆酶經過酶活測定顯示，最適溫度為25~45°C。
[0027]以同樣類似的方法測試漆酶對pH的適應性，漆酶酶活力測定方法采用愈創木酚法，酶活單位定義為在25°C條件下每分鐘使I μ mol的底物轉化所需的酶量。經試驗發現，漆酶的最適PH= 3.5-6.5。
[0028]實驗結果顯示，在上述溫度和pH范圍內，漆酶酶活保持在80 %以上，適于工業應用。
[0029]實施例3
[0030]以漆酶lcc4為例，說明本發明漆酶在畢赤酵母中的重組表達過程:
[0031]采用Eco RI&Not I限制兩端帶有酶切位點的lcc4基因以及pPIC9K，膠回收產物，T4連接酶連接，轉化E.coli ToplO，次日鑒定轉化子，取陽性克隆測序。測序正確者用于下游實驗。
[0032]準備8ug的質粒DNA (克隆至pPIC9K的重組子)，用Sac I線性化質粒，乙醇沉淀，回收DNA待用。
[0033]取80ul P.pastoris GSl 15感受態細胞和5ug線性化的質粒DNA混合，混合均勻后，加入至電轉杯中，1500V電轉后,馬上加入1ml預冷的sorbital,將液體取出后放入至一新管中，30°C溫浴半小時，每300ul涂布于一個MD平板，30°C倒置培養至白色的菌落長出。
[0034]影印轉化子至含有3mg/ml G418的YEH)平板上，30°C倒置培養2天左右，挑取那些在3mg/ml G418的YETO長得很好的菌落到普通的YETO平板上，30°C培養兩天，再將其接種至30ml的BMGY液體培養基，紗布纏好瓶口，30°C，220rpm培養30小時，離心收集菌體，用15mlBMMY液體培養基重懸菌體，將菌液放入另一無菌的150ml搖瓶中，繼續于30°C，220rpm培養72小時，并且每24小時加入150ul甲醇維持誘導。
[0035]誘導結束后，離心取上清進行SDS-PAGE檢測。
[0036]實施例4
[0037]漆酶在染料降解中的方面的應用。
[0038]使用可見光分光光度計，通過記錄單位時間內染料在最大吸收波長處的OD值變化計算脫色率(％):A0-A/A0X100% ,其中，AO為染料的初始吸收OD值，A為染料的終止吸收OD值。
[0039]選取偶氮類染料ARl (30mg/L)、RB5 (50mg/L)、，反應體系為3mL，包括0.5mL漆酶酶液(6U/mL)、1.0mL合成染料、1.5mL的20mmol/L，pH3.0的磷酸-檸檬酸緩沖液。在常溫下反應2h，進行最大吸收波長下的OD值測量，根據公式計算脫色率，結果如下表1所示。
[0040]表1:漆酶lcc4對染料的脫色能力
[0041]

【權利要求】
1.一種茄鐮刀菌漆酶lcc4，其特征在于相關蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，該茄鐮刀菌漆酶對應的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.權利要求1所述茄鐮刀菌漆酶基因的克隆方法，其特征在于包括下述步驟:I)以木質素為唯一碳源培養茄鐮刀菌菌株，然后回收菌體，提取其總RNA并反轉錄得到cDNA ；2)對所得cDNA進行擴增得到茄鐮刀菌菌株的漆酶基因部分序列進行測序。
3.根據權利要求2所述的克隆方法，其特征在于所用引物序列為
Lac-Fl: CAAGGGAACGACCATGCAYTDBCAYGG ；
Fus-Rl:CCACTTCGAAGTGCCAATCTANRTGRCARTGdIA。
4.權利要求1所述茄鐮刀菌漆酶基因的重組表達方法，其特征在于采用畢赤酵母作為載體。
5.根據權利要求4所述的重組表達方法，其特征在于包括下述步驟:I)使用EcoR1、Not I限制兩端帶有酶切位點的鐮刀菌漆酶基因以及PPIC9K，膠回收產物，T4連接酶連接，轉化到E.coli ToplO，鑒定轉化子，取陽性克隆進行測序；2)將質粒DNA(克隆至pPIC9K的重組子)，用Sac I線性化質粒，沉淀并回收DNA ；3)取畢赤酵母感受態細胞和線性化的質粒DNA混合均勻后電轉化，電轉化器完成后加入預冷的山梨醇溶液，將液體涂布MD平板，培養至白色的菌落長出；4)影印轉化子至含有抗生素的YEH)平板培養，挑取長勢良好的菌落到普通YEH)平板上培養將其接種至BMGY液體培養基；5)培養后離心收集菌體，用BMMY液體培養基重懸菌體，將菌液放入另一無菌搖瓶中繼續培養并加入甲醇維持誘導。
【文檔編號】C12N15/81GK104073475SQ201410271201
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月17日 優先權日:2014年6月17日
【發明者】趙辛, 吳兆韡, 司瑋 申請人:西北農林科技大學