專利名稱：再育鐮刀菌zjb-09150及在生物合成煙酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株產腈水解酶菌株一再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)ZJB-09150，及其在煙酸合成中的應用。
背景技術：
煙酸(Nicotinic Acid),又稱為3_卩比唳甲酸(3-picoline acid),即維生素B3,是結構最簡單，理化性質最穩定的一種維生素。煙酸為白色結晶或結晶性粉末，無臭或有微臭，水溶液呈酸性反應，熔點234 237°C。易溶于沸水和沸乙醇，溶于苛性堿、碳酸鈉，不溶于乙醚和酯類。煙酸在醫藥、食品和飼料及化學工業中有著廣泛的應用前途。煙酸在機體組織中的氧化還原過程中發揮重要作用，具有促進細胞新陳代謝和擴張血管的功能，能促進人體和動物的生長發育。煙酸作為藥品可防治皮膚病和類似的維生素缺乏癥，具有擴張血管的作用，用于醫治末梢神經痙攣，動脈硬化等病癥。煙酸還具有生理和化學活性的精細中間體、醫藥中間體，用它可以開發一系列高附加值的產品，如煙酸鉻、煙酸肌醇酯、VE煙酸酯、2-氯煙酸等。因此對煙酸的研究具有重要的實際應用價值。煙酸最初是通過尼古丁氧化制得的。目前合成多以烷基吡唆，如3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、甲基戊二氰、6-羥基喹啉、萘和吡啶-3-甲醛等為原料。從合成方法看，可分為試劑氧化法、氨氧化法、氣相氧化法、液相氧化法、電解氧化法、生物氧化法和光
化學氧化法等。(I)試劑氧化法試劑氧化法是發展最早的制備煙酸的方法之一，使用的氧化劑有KMnO4, HNO3或NO2、濃H2SO4或S03、H2SO4和HN03、O3或H2O2等，其中以HNO3作為氧化劑最為普遍。3-甲基吡唆、2-甲基-5-乙基吡唆、喹啉、6-羥基喹啉、萘和植物中的尼古丁或鹽堿的衍生物均可在上述氧 化劑作用下生成煙堿，總收率為67-86%。(2)氧氣氧化法日產化學工業株式會社以鈷、錳及鈰等金屬的醋酸鹽與溴的氫化物為催化劑，以純氧或氧與其它惰性氣體的混合物為氧化劑，在無溶劑的液相中氧化3-甲基吡啶得到煙酸，多次循環由3-甲基吡啶制得煙酸的轉化率可達80%左右。(3)氨氧化法氨氧化法主要是以3-甲基吡啶或2-甲基-5-乙基吡啶為原料，用空氣、氯氣和水蒸氣混合氣體高溫催化氧化，得到吡啶腈，然后在氨氣和氫氧化鈉的水溶液中水解得煙酸。氨氧化的催化劑有Mo，V，Fe，Ti，Zr等的磷酸鹽V205/Ti02、Sb-V-Ti氧化物、VaTibZrcOx、V205/A1F3、Sb-V_SAP0_5等。氨氧化法原料價廉易得，可連續大規模生產。在常壓或低壓下反應，產率較高，純度也較高，生產安全可靠，是工業上制備煙酸廣泛采用的方法。其缺點是從原料烷基吡啶出發到制得產品至少需要兩步以上的化學反應，且反應溫度較高、催化劑制備有一定困難，不但加大了設備投資，而且增加了成本。(4)空氣氧化法以空氣或富氧空氣做氧化劑，高溫催化氧化3-甲基吡啶制得煙酸。所用的催化劑多數是五氧化二釩與鉻、錫、鉛、鈦、鋁、鋯等氧化物的組合物或含氧酸化合物，如改性的 V2O5, V205/Zr0 2，V205/Sn02, V205/Ti02，還有用 Crl-xAlxV04 和 CrVl_xPx04 等作催化劑的情況。由于催化劑不同.反應溫度不同，一般煙酸的收率在61% 86. 8%之間。
以上方法具有氧化劑價格昂貴，過程復雜，產物難分離，污染高及對生產設備要求也高等缺點。近年來生物技術領域的突破性進展，使生物催化在化學合成中日趨重要。利用腈轉化酶生物催化生產酰胺、羧酸及其衍生物是一種非常有效的生產方法，可以極大地降低能耗、節省原料、減少污染，將生物技術應用于腈化合物的轉化合成，已經引起人們的高度重視和關注。這一切給生物法生產煙酸的發展帶來了機遇。

發明內容
本發明目的是提供一株產腈水解酶的新菌株，及其在生物催化3-氰基吡啶制備煙酸中的應用。本發明采用的技術方案是本發明提供一株產腈水解酶新菌株-再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)
ZJB-09150,保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No :M2011472，保藏日期2011年12月15日。所述再育鐮刀菌ZJB-09150菌株是從來自浙江省內(杭州、金華、臺州)等地100余份土樣中，經初篩、復篩及分離純化而得到的能高效的催化3-氰基吡啶制備煙酸的新菌株。根據它的生理生化特征，鑒定為再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)。所述再育鐮刀菌ZJB-09150菌株的主要生理生化特征如下菌落形態于28°C在PDA平板培養基培養4d，菌落直徑5cm左右，菌落呈同心圓狀，菌落周邊白色絨毛狀，內環淺褐色，中心有小突起。生理生化特征對碳源陽性利用項目吐溫40、N_乙酰-D-葡糖胺、β -環糊精、糊精、L-果糖、D-葡萄糖酸、甘油、肝糖、2-酮-D-葡萄糖酸、D-甘露醇、D-核糖、水楊苷、L-山梨糖、反丁烯二酸、L-乳酸 、D-蘋果酸、L-蘋果酸、D-糖二酸、琥珀酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、2-乙醇胺。對碳源陰性利用項目Ν-乙酰-D半乳糖胺、N-乙酰-D甘露糖胺、核糖醇、D-纖維二糖、a-環糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、龍膽二糖、D-氨基葡萄糖、a-D-葡萄糖、a-D-葡萄糖-1-磷酸、葡糖醛酰胺、D-葡萄糖醛酸、m-肌糖、a-D-乳糖、乳果糖、麥芽糖醇、麥芽糖、麥芽三糖、D-松三糖、a-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-半乳糖苷、a-甲基-D-葡萄糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、帕拉金糖、D-阿洛酮糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、景天庚醛聚糖、水蘇糖、蔗糖、D-塔格糖、D-海藻糖、松二糖、D-木糖、溴代琥珀酸、β -羥丁酸、Y-羥丁酸、β -羥基苯乙酸、a-酮戊二酸、D-乳酸甲酯、癸二酸、琥珀酸甲酯、N-乙酰-L-谷氨酸、L-丙氨酰胺、甘氨酰-L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、腐胺、腺苷、尿苷、腺苷-5’-磷酸。所述再育鐮刀菌ZJB-09150菌株18S DNA擴增產物的實際長度為521bp，SEQ IDNO.1序列如下TCTACCTGATCCGAGGTCACATTCAGAAGTTGGGGGTTTAACGGCTTGGC CGCGCCGCGTACCAGTTGCGAGGGTTTTACTACTACGCAATGGAAGCTGC AGCGAGACCGCCACTAGATTTCGGGGCCGGCTTGCCGCAAGGGCTCGCCG ATCCCCAACACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACA GGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGA TGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTT CTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTAT TTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTC TGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACA ATTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCT CCGCAGGTTA ACCCTACGGAG本發明還提供所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用，所述應用為以再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，于ρΗ7. (ΓΙΟ. O的緩沖溶液中構成轉化反應體系，在35飛5°C條件下進行轉化反應，反應完全后，獲得的轉化反應液即為含煙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得所述煙酸。進一步，所述在35 55°C條件下轉化反應時間優選為l(Tl20min。進一步，所述反應體系中底物的初始終濃度為1.(T5.0g/L，所述再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體的質量用量以菌體干重計為2. 5 5g/L。進一步，所述催化劑按如下步驟獲得(I)斜面培養將再育鐮刀菌Z JB-09150接種至斜面培養基，在28 30°C培養72 84h，獲得斜面菌體；所述斜面培養基的終濃度組成為葡萄糖10. (Γ20. O g/L，酵母膏3. (Γ6. O g/ L，氯化鈉 1.0 2.0 g/ LjK2HPO4 ·3Η20 O. 2 O. 4 g/ LjMgSO4 O. 2 O. 4 g/ L，瓊脂 15. 0 20· O g/ L，pH6. 5 7. 0，溶劑為水；(2)種子培養從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，28 3(TC培養6(T72h，得到種子液；所述種子培養基終濃度組成為葡萄糖10. (Γ20. O g/L,酵母膏3. 0 6· O g/ L，氯化鈉1. 0 2· O g/ L, K2HPO4 · 3H20 O. 2 O. 4 g/ L, MgSO4 O. 2 O. 4 g/ L,PH6. 5 7.0，溶劑為水；

(3)發酵培養將步驟(2)獲得的種子液以2飛％體積比接種至發酵培養基，在28 30°C、初始pH 6. 5^7. O條件下震蕩培養72、6 h，培養液離心分離，棄去上清，取沉淀即得到所述含酶濕菌體；所述發酵培養基終濃度組成為:蔗糖3. (Γ6.0 g/ L，牛肉膏2. (Γ4.0g/ L, NaNO2 2. 0 4· O g/ L, K2HPO1 · 3H.0 O. Γθ. 2 g/ L, MgSO1 · 7H.0 O. 5 1. O g/ LiKClO. 5 1. O g/ L, FeSO1 · 7H.0 O. 02、. 04 g/ L,己內釀胺 4. O 8. O g/ L, pH 6. 5 7. O,溶劑為水。進一步，所述混合液分離純化的方法為:轉化結束后，將轉化反應液離心，棄沉淀，取上清液用孔徑O. 45 μ m微濾膜過濾，濾液抽真空濃縮至無溶劑流出，取濃縮物加入無水乙醇，冷卻結晶，取晶體干燥，獲得所述煙酸。更進一步,所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用按如下步驟進行將再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體與3-氰基吡啶混合，于pH9. O的Tris-HCl緩沖溶液中構成轉化反應體系，在55°C條件下轉化反應lOmin，反應結束后，獲得的轉化反應液即為含所述煙酸的混合液，將混合液在IOOOOrpm離心lOmin，棄沉淀，取上清液用孔徑O. 45 μ m微濾膜過濾，濾液真空濃縮至無溶劑流出，取濃縮物加入無水乙醇，冷卻結晶，取晶體干燥，獲得所述煙酸；所述再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體的質量用量以菌體干重計為2. 5g/L，所述3-氰基吡啶的初始終濃度為1. 2g/L。本發明所述再育鐮刀菌ZJB-09150含酶濕菌體制備方法推薦為(I)斜面培養將再育鐮刀菌ZJB-09150接種至斜面培養基，28°C培養72h，獲得斜面菌體；所述斜面培養基終濃度組成為葡萄糖10. O 8/1，酵母膏3.0 g/ L，氯化鈉1. O g/L，K2HPO4 · 3H20 O. 2 g/ L，MgSO4 O. 2 g/ L，瓊脂 15. O g/ L，ρΗ7· 0，溶劑為水；
(2)種子培養從步驟(I)斜面菌體挑取一環菌體，接種至50. O ml無菌種子培養基，28°C條件下培養72h，獲得種子液；種子培養基終濃度組成為葡萄糖15. 0g，酵母膏5g，氯化鈉1. 5 g, K2HPO4 · 3H20 O. 3g，MgSO4 O. 3 g, pH 7. 0，水補足至1. 0L，培養基 121°C滅菌20分鐘；(3)發酵培養將步驟(2)獲得的種子液以體積比5%的接種量接種至發酵培養基，28°C、、初始pH 6. 5 7. O、150rpm條件下震蕩培養96h，收集發酵液，IOOOOrpm離心IOmin后，棄上清收集濕菌體，濕菌體用質量濃度O. 95%生理鹽水洗滌3次，收集的菌泥即為含酶濕菌體，具有3-氰基吡啶水解活性的生物催化劑，4°C冰箱保藏、備用；所述發酵培養基終濃度組成為蔗糖 3. O g/ L，牛肉膏 2. O g/ L，NaNO 3 2. O g/ L, K2HPO4 · 3H20 O.1 g/ L，MgSO4 ·7Η20 O. 5g/ L，KC1 0.5 g/ L，FeS04.7H20 0. 02 g/ L，己內酰胺 4.0 g/ L，pH 7.0，溶劑為水。本發明所述再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體的菌體干重測量方法為測量單位菌濁度、單位體積的菌體細胞干重，得0D_與菌體細胞干重的關系曲線，可以獲得各階段的菌體干重。本發明所述檢測產物煙酸的高效液相色譜條件為日本島津液相色譜儀，不銹鋼填充柱，填料為C18,長O. 25m,內徑4. 6mm,流速lml/min,柱溫室溫,流動相為乙腈0· 1%磷酸水溶液(25V: 75V)，進樣量為10μ I。其中，煙酸出峰時間為4.2 min。采用外標法確定樣品中煙酸的含量。本發明的有益效果主要體現在(I)本發明從微生物群中篩選得到可生物催化生產煙酸的新菌株再育鐮刀菌 ZJB-09150 (Fusarium proliferatum)CCTCC NO :M2011472，其在適合條件下，能有效生產煙酸；(2)本發明將再育鐮刀菌ZJB-09150用于生物催化生產煙酸實驗，結果表明，該菌可有效生物催化生產煙酸，15分鐘內60mM3-氰基吡啶轉化率可達到100%，因此該菌在生物催化生產煙酸的領域中具有廣泛的應用前景。


圖1為菌株ZJB-09150單菌落形態照片(放大倍數IOX 100)；圖2為菌株ZJB-09150單菌落掃描電鏡圖(放大倍數I X 12000)；圖3為菌株16S rDNA序列PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4為ZJB-09150菌株與NCBI上的菌株的進化樹分析結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 :新菌株ZJB-09150的篩選從將由浙江省杭州市某藥廠附近采集的土樣和污水樣接種到富集培養基中；在28 0C，150rpm的搖床上富集培養72h后，再取2ml培養液接種到新鮮的富集培養基上進行二次培養，如此重復3個循環。最后一次培養液稀釋后涂布到葡萄糖酵母膏平板培養基上，28°C培養72h獲得單菌落，挑取單菌落接種到斜面培養基進行保藏。從斜面培養基挑取一接種環菌種接種到發酵培養基，在28°C、初始pH6. 5 7. O條件下震蕩培養96h，離心分離，棄去上清，取沉淀即得到含酶濕菌體；將含酶濕菌體分別懸浮于PH7. O磷酸緩沖液中，通過加Λ 3-氰基吡啶作為底物進行轉化實驗。將上述O.1g含酶濕菌體分別加入初始終濃度為IOmM的3-氰基吡啶的磷酸緩沖液的反應體系中，35°C反應30分鐘后，將反應液離心，取上清液分別用高效液相色譜檢測煙酸的含量，選擇有轉化活性的菌株，最終選擇出一株轉化活性最高的菌株(編號為ZJB-09150，即CCTCC NO M2011472)做后續的菌種鑒定及轉化條件優化實驗。所述富集培養基配方為(終濃度)葡萄糖5 g/1，K2HPO4 · 3H20 O. 5 g/1，KH2PO4O. 5 g/1, MgSO4 0. 5 g/1, FeSO4 · 7H20 0. 02 g/1,己內酰胺 4 g/1, pH7. 0，溶劑為水。培養基 121。。，滅菌 20min。所述發酵培養基配方為(終濃度)蔗糖3 g/Ι，牛肉膏2 g/1, NaNO3 2 g/1,K2HPO4 · 3H20 O.1 g/1, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/1, KCl 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02 g/1,己內酰胺4 g/l，pH7.0，溶劑為水。所述葡萄糖酵母膏平板培養基配方為(終濃度)蔗糖3 g/Ι，牛肉膏2 g/1, NaNO32 g/1, K2HPO4 · 3H20 O.1 g/1, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/1, KCl 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02 g/1,己內酰胺4 g/1, pH7. 0，瓊脂20g/L，溶劑為水。實施例2 :新菌株Z JB-09150的鑒定實施例1中從土壤中經過富集培養然后用稀釋涂布法，經過高效液相色譜檢測篩選得到一株活性最強的菌株標號為ZJB-09150，單菌落的顯微照片見圖1所示，電鏡掃描照片見圖2所示，菌落直徑3. 7cm左右，呈同心圓狀，菌落周邊白色絨毛狀，內環淺黃色，稍突起。利用Biolog (GEN III)自動微生物鑒定系統對菌株ZJB-09150進行了 94種表型測試(Biolog微生物自動鑒定專用試劑及培養基等購自Biolog公司),經Biolog讀數儀分析代謝指紋，菌株ZJB-09150鑒定結果，如表I所示。表I菌株ZJB-09150對Biolog GEN III板上71種碳源和23種化學物質的利用能力
權利要求
1.再育鐮刀菌(Fusariumproliferatum) ZJB-09150,保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No :M2011472，保藏日期2011年12月15日。
2.—種權利要求1所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用，其特征在于所述應用為以再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，于pH7. (TlO. 0的緩沖溶液中構成轉化反應體系，在35飛5°C條件下進行轉化反應，反應完全后，獲得的轉化反應液即為含煙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得所述煙酸。
3.如權利要求2所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用，其特征在于所述35 55°C條件下轉化反應時間為l(Tl20min。
4.如權利要求2所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用，其特征在于所述反應體系中底物的初始終濃度為1. (T5. Og/L，所述再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體的質量用量以菌體干重計為2. 5^5. Og/L。
5.如權利要求2所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用，其特征在于所述催化劑按如下步驟獲得 (1)斜面培養將再育鐮刀菌ZJB-09150接種至斜面培養基，在28 30°C培養72 84h，獲得斜面菌體；所述斜面培養基的終濃度組成為葡萄糖10. (T20.0 g/L，酵母膏3.0飛.0 g/L，氯化鈉 1.0 2.0 g/ LjK2HPO4 *3H20 0. 2 0. 4 g/ LjMgSO4 0. 2 0. 4 g/ L，瓊脂 15. 0 20. 0g/ L，pH6.5 7.0，溶劑為水； (2)種子培養從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，28 3(TC培養6(T72h，得到種子液；所述種子培養基終濃度組成為葡萄糖10.(T20.0 g/L，酵母膏3.0 6. 0 g/ L，氯化鈉1. 0 2. 0 g/ L, K2HPO4 3H20 0. 2 0. 4 g/ L, MgSO4 0. 2 0. 4 g/ L,PH6. 5 7.0，溶劑為水； (3)發酵培養將步驟(2)獲得的種子液以2飛％體積比接種至發酵培養基，在28 30°C、初始pH 6. 5^7. 0條件下震蕩培養72、6 h，培養液離心分離，棄去上清，取沉淀即得到所述含酶濕菌體；所述發酵培養基終濃度組成為:蔗糖3. (T6.0 g/ L，牛肉膏2. (T4.0g/L, NaNO, 2. 0^4. 0 g/L, K^HPO1 3H.0 0.廣0. 2 g/L, MgSO1 7H.0 0. 5 1. 0 g/L, KCl0. 5 1. 0 g/L, FeSO1 7H.0 0. 02 0. 04 g/L,己內釀胺 4.0 8. 0 g/L, pH 6. 5 7. 0,溶劑為水。
6.如權利要求2所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用，其特征在于所述混合液分離純化的方法為轉化結束后，將轉化反應液離心，棄沉淀，取上清液用孔徑0. 45 y m微濾膜過濾，濾液進行真空濃縮，濃縮物加入無水乙醇，冷卻結晶，取晶體干燥，獲得所述煙酸。
7.如權利要求5所述再育鐮刀菌ZJB-09150在生物轉化合成煙酸中的應用，其特征在于所述應用按如下步驟進行將再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體與3-氰基吡啶混合，于pH9. 0的Tris-HCl緩沖溶液中構成轉化反應體系，在55°C條件下轉化反應lOmin，反應結束后，轉化反應液即為含所述煙酸的混合液，將所述混合液在IOOOOrpm離心IOmin,棄沉淀,取上清液用孔徑0. 45 ii m微濾膜過濾,濾液真空濃縮,取濃縮物加入無水乙醇，冷卻結晶，取晶體干燥，獲得所述煙酸；所述再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體 的質量用量以含酶濕菌體的菌體干重計為2. 5g/L，所述3-氰基吡啶的初始終濃度為1. 2g/L。
全文摘要
本發明公開了一種再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)ZJB-09150及在生物合成煙酸中的應用，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢，武漢大學，保藏編號CCTCC NoM2011472，保藏日期2011年12月15日；所述合成煙酸的方法為以再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，于pH7.0~10.0的緩沖溶液中構成轉化反應體系，在35~55℃條件下進行轉化反應，反應完全后，轉化反應液即為含煙酸的混合液，混合液分離純化獲得所述煙酸；本發明提供新菌株再育鐮刀菌ZJB-09150，該菌可有效生物催化生產煙酸，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12R1/77GK103045486SQ201210386670
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月12日 優先權日2012年10月12日
發明者鄭裕國, 金利群, 柳志強, 沈寅初 申請人:浙江工業大學