美國白蛾恒溫核酸檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種美國白蛾核酸的恒溫檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒組成包括：1）DNA檢測裝置；2）美國白蛾核酸恒溫擴增反應液；3）陽性對照：為含有美國白蛾線粒體COI基因的DNA片段；4）陰性對照：為無菌雙蒸水。本發明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高；反應速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需1~1.5小時；可同時滿足中通量和低通量的樣品檢測，特別適合現場檢測使用，且整個反應過程只需一個恒溫儀器。
【專利說明】美國白蛾恒溫核酸檢測試劑盒及其檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于美國白蛾檢測【技術領域】，具體涉及一種美國白蛾恒溫核酸的檢測試劑 盒及其檢測方法。

【背景技術】
[0002] 美國白蛾（Hyphantria cunea) (Drury)又名美國燈蛾（白蛾屬），是舉世矚目的世 界性檢疫害蟲。主要危害果樹、行道樹和觀賞樹木，對園林樹木、經濟林、農田防護林等造成 嚴重的危害。目前已被列入我國首批外來入侵物種。美國白蛾最主要的擴展途徑可由各個 蟲態隨貨物借助于交通工具進行傳播。以4齡以上的幼蟲和蛹傳播的機會最多。近幾年屢 見該蟲隨由國外運入的包裝箱輸入中國，應引起注意。美國白蛾侵入中國后，失去了原有天 敵的控制，其種群密度迅速增長并蔓延成災。據吳堅介紹，統計顯示，每年因生物入侵給中 國林業造成的損失達660億。
[0003] 為了治理美國白蛾，早在1981年國務院辦公廳轉發了農業部、林業部《關于加強 對美國白蛾檢疫和防治工作的報告》的通知；1984年國務院、中央軍委發出《關于迅速撲陜 西境內美國白蛾的緊急通知》；北方各省市政府都成立了由地方主要領導參加的美國白蛾 防治領導小組，如1995年天津發現美國白蛾后，1996年北京市成立"嚴防指揮部"，以杜絕 美國白蛾進京。西安、咸陽、錦州等地利用人工、機械、化學等方法成功控制了美國白蛾的危 害。
[0004] 目前，加強植物檢疫，對來自疫區的苗木、接穗、花卉、鮮果及包裝箱填充物和交通 工具等必須嚴格檢疫。對來自疫區的木材、苗木、鮮果、蔬菜以及饈箱、填充物和交通工具都 必須認真檢查。總體說來，缺乏實際有效的能應用與現場的快速有效的檢測技術。核酸檢 測是一種快速特異的檢測方法。常規的PCR技術雖然具備快速、靈敏、特異等特點，但由于 實驗室擴增物污染極易造成假陽性結果而限制了其在臨床上的廣泛應用。而且進口診斷試 劑則由于采購供貨周期長，價格昂貴，基層單位難于常規應用。近年來的發展起來的熒光定 量PCR (Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR)技術以其靈敏度高，速度快，特異性強 等優點在基因檢測水平上有著廣泛的應用，但目前國內市場上尚未有關于美國白蛾定量檢 測試劑盒。FQ-PCR雖然有著簡便，快速，靈敏的優勢，但是其檢測需要昂貴的儀器，且容易造 成假陽性等問題。


【發明內容】

[0005] 發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種美國白蛾恒 溫核酸的檢測試劑盒，利用交叉引物核酸恒溫擴增以及封閉式核酸擴增物快速檢測美國白 蛾。本發明的另一目的在于提供上述試劑盒的檢測方法。
[0006] 技術方案：為了實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為： 一種美國白蛾核酸的恒溫檢測試劑盒，組成包括： (1)美國白蛾核酸恒溫擴增反應液； (2) DNA檢測裝置； (3) 陽性對照：為含有美國白蛾線粒體COI基因的DNA片段； (4) 陰性對照：為無菌雙蒸水； 其中，美國白蛾核酸恒溫擴增反應液的組成為：〇.〇1?0.05 μ mol正向外圍引物； 0. 01?0. 05 μ mol反向外圍引物；0. 01?0. 05 μ mol反向交叉引物；0. 1?0. 5 μ mol正向 探針；0.1?0.5 4 1]1〇1反向探針；3?6111皿)1]\%304;0.2?0.41111]1〇1(11'01:>8溶液；6?101168七 DNA聚合酶；2yL Betaine (5Μ);2μ? 10XThermol buffer ;無菌雙蒸水補足到 18μ?; 正向外圍引物序列為：AGCAGGAACTGGATGAACA ;反向外圍引物序列為： GTATGGTAATAGCTCCAGC ;反向交叉引物序列為：ATTACTACAATCATTAACATACGAITTTCCTACTGCT CATACGAA ;正向探針為5'端標記Biotin序列：ATTACTACAATCATTAACATACGATT ;反向探針為 5' 端標記 FitC 的序列：AATTTATCATTTGATCAAATACCT。
[0007] 所述美國白蛾核酸恒溫擴增反應液，優選組成為：0.03?0.05 μ mol正向外圍引 物；0. 03?0. 05 μ mol反向外圍引物；0. 03?0. 05 μ mol反向交叉引物；0. 3?0. 5 μ mol 正向探針；〇· 3?0· 5 μ mol反向探針；5?6mmol MgS04 ;0· 3?0· 4mmo1 dNTPs溶液；8? 10U Bst DNA 聚合酶；2μ? lOXThermol buffer;無菌雙蒸水補足到 18μ?。
[0008] 所述美國白蛾核酸恒溫擴增反應液的組成，再優選為：0. 05 μ mol正向外圍引物； 0.05 μ mol反向外圍引物；0.05 μ mol反向交叉引物；0.5 μ mol正向探針；0.5 μ mol反向 探針；6mmol MgS04 ;0· 4mmol dNTPs 溶液；2 μ L Betaine (5M) ;10U Gst DNA 聚合酶；2 μ L lOXThermol buffer ;無菌雙蒸水補足到18μ L。
[0009] 所述的 lOXThermol buffer 含有摩爾濃度為 20mM 的 Tris-HCl、10mM 的 KCl、10mM 的（NH4) 2S04、2mM 的 MgS04 以及質量濃度為 0· 1% 的 Triton Χ-100, ρΗ8· 8。
[0010] 所述DNA檢測裝置為全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置，所使用的試紙條為用 于核酸擴增物檢測的試紙條。
[0011] 所述陽性對照的含有美國白蛾線粒體C0I基因的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 6 所示。
[0012] 一種所述美國白蛾核酸的檢測試劑盒的檢測美國白蛾的方法，具體步驟為： a) 使用常規DNA提取方法從待檢測的標本中提取DNA樣品； b) 將步驟a)提取得到的DNA樣品作為模板加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中， 在60?65°C下擴增反應60?65分鐘，對照PCR管中分別加入標準陽性模板和標準陰性模 板； c) 將反應后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置中進行檢測，15分鐘以后判讀結果。
[0013] 步驟b)中，在63°C下擴增反應60分鐘。
[0014] 美國白蛾陽性對照中的美國白蛾DNA制備方法，包括下列步驟： (1) 利用兩條外圍引物進行PCR擴增獲得目的基因； (2) 對步驟（1)得到的PCR擴增產物進行純化； (3) 將步驟（2)得到的純化后的擴增產物通過質粒轉染試劑盒構建完整的含有目的基 因的質粒序列； (4) 將所抽提的質粒定量并稀釋至106拷貝/ μ L，-20°c保存。
[0015] 其中，在步驟（2)中，采用Promega的PCR純化試劑盒對PCR擴增產物進行純化； 在步驟（3)中采用Promega的T-easy質粒轉染試劑盒。
[0016] 有益效果：與現有技術相比，本發明的優點如下：本發明的檢測試劑盒特異性高、 靈敏度高；反應速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需1~1. 5小時；可同時滿足中 通量和低通量的樣品檢測，特別適合現場檢測使用，且整個反應過程只需一個恒溫儀器。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是試紙條的檢測線結果圖； 圖2是利用檢測試劑盒檢測美國白蛾的靈敏度的實驗結果圖；圖中，序號1-7依次為 1〇4個菌/ μ L、103個菌/ μ L、102個菌/ μ L、101個菌/ μ L、10°個菌/ μ L的菌液、TB陽性對 照品（1〇4拷貝/mL)、空白對照。

【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例對本發明進一步說明。
[0019] 實施例1檢測試劑盒的組成與配制 (l)DNA檢測裝置：CN1811447A中所公開的核酸薄膜層析快速檢測方法的試紙條， CN1888902A中所公開的全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置。
[0020] (2)美國白蛾核酸恒溫擴增反應液：兩條外圍引物（0.05μπι〇1)，兩條探針 (0· 5 μ mol)，和擴增交叉引物（0· 5 μ mol)，10XThermol buffer，MgS04 (6mmol), dNTPs 溶 液（0.4mm〇l)，Bst DNA聚合酶（10U)和無菌雙蒸水組成，總反應液體積為18yL。其中： 兩條外圍引物的正向外圍引物序列為5 ' - AGCAGGAACTGGATGAACA-3 '，反向外圍引物序列 為5' - GTATGGTAATAGCTCCAGC-3' ；兩條探針的序列分別為：正向5'端Biotin標記探針 5' -biotin- ATTACTACAATCATTAACATACGATT-3'，反向 5' 端異硫氰酸熒光素標記探針 5' -Fi tC-AAITTATCAITTGATCAAATACCT-3' ；一條擴增交叉引物為：5' -ATTACTACAATCATTAACATACGA TTTTCCTACTGCTCATACGAA-3'。
[0021] lOXThermol buffer 的組成：20mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，10mM KC1，10mM (NH4)2S04， 2mM MgS04,0. 1% Triton X-100。
[0022] 所有的引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。
[0023] 陽性對照：美國白蛾DNA模板(為含有美國白蛾線粒體C0I基因的DNA片段，SEQ ID N0. 6所示序列)。制備步驟：利用兩條外圍引物和以美國白蛾的基因組DNA模板進行PCR 擴增獲得目的基因；用Promega的PCR純化試劑盒對PCR擴增產物進行純化；將純化后的 擴增產物通過Promega的T-easy質粒試劑盒，構建含有目的基因片段的質粒；用分光光度 計測A 28Q定量并稀釋至106拷貝/ μ L，-20°C保存。
[0024] 陰性對照：無菌雙蒸水。
[0025] 實施例2用實施例1的試劑盒檢測美國白蛾核酸的方法 以包括美國白蛾在內的16種燈蛾科昆蟲作為供試標本，這16種燈蛾科昆蟲成幼蟲在 外部形態上都與美國白蛾難以區分。供試標本詳見表1。
[0026] 表1供試標本

【權利要求】
1. 一種美國白蛾核酸的恒溫檢測試劑盒，其特征在于，組成包括： (1) 美國白蛾核酸恒溫擴增反應液； (2) DNA檢測裝置； (3) 陽性對照：為含有美國白蛾線粒體COI基因的DNA片段； (4) 陰性對照：為無菌雙蒸水； 其中，美國白蛾核酸恒溫擴增反應液的組成為：〇.〇1?0.05 μ mol正向外圍引物； 0. 01?0. 05 μ mol反向外圍引物；0. 01?0. 05 μ mol反向交叉引物；0. 1?0. 5 μ mol正向 探針；0.1?0.5 4 1]1〇1反向探針；3?6111皿)1]\%304;0.2?0.41111]1〇1(11'01:>8溶液；6?101168七 DNA聚合酶；2yL Betaine (5Μ);2μ? 10XThermol buffer ;無菌雙蒸水補足到 18μ?; 正向外圍引物序列為：AGCAGGAACTGGATGAACA ;反向外圍引物序列為： GTATGGTAATAGCTCCAGC ;反向交叉引物序列為：ATTACTACAATCATTAACATACGAITTTCCTACTGCT CATACGAA ;正向探針為5'端標記Biotin序列：ATTACTACAATCATTAACATACGATT ;反向探針為 5' 端標記 FitC 的序列：AATTTATCATTTGATCAAATACCT。
2. 根據權利要求1所述的美國白蛾核酸的檢測試劑盒，其特征在于：所述美國白蛾核 酸恒溫擴增反應液的組成為：〇· 03?0· 05 μ mol正向外圍引物；0· 03?0· 05 μ mol反向 外圍引物；〇. 03?0. 05 μ mol反向交叉引物；0. 3?0. 5 μ mol正向探針；0. 3?0. 5 μ mol 反向探針；5 ?6mmol MgS04 ;0· 3 ?0· 4mmol dNTPs 溶液；8 ?10U Bst DNA 聚合酶；2 μ L lOXThermol buffer ;無菌雙蒸水補足到18μ L。
3. 根據權利要求1或2所述的美國白蛾核酸的檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA檢 測裝置為全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置，所使用的試紙條為用于核酸擴增物檢測的 試紙條。
4. 根據權利要求1所述的美國白蛾核酸的檢測試劑盒，其特征在于：所述陽性對照的 含有美國白蛾線粒體C0I基因的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
5. -種權利要求1所述美國白蛾核酸的檢測試劑盒的檢測美國白蛾的方法，其特征在 于，具體步驟為： a) 使用常規DNA提取方法從待檢測的標本中提取DNA樣品； b) 將步驟a)提取得到的DNA樣品作為模板加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中， 在60?65°C下擴增反應60?65分鐘，對照PCR管中分別加入標準陽性模板和標準陰性模 板； c) 將反應后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置中進行檢測，15分鐘以后判讀結果。
6. 根據權利要求5所述的美國白蛾核酸的檢測試劑盒的檢測美國白蛾的方法，其特征 在于，步驟b)中，在63°C下擴增反應60分鐘。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099413SQ201410271083
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】詹國輝, 鄭斯竹, 陳景云, 葛華林 申請人:蘇州市外來有害生物防控技術中心