Kap26.1基因作為引入絨山羊細胞改善絨毛細度的外源基因的應用的制作方法
【專利摘要】本發明發現了KAP26.1基因對遼寧絨山羊絨細度產生調控作用，即KAP26.1基因表達量越高，則絨毛細度越小；同時，KAP26.1基因的高表達會促使KAP7.1，KAP11.1等基因的表達量增高，這些基因的增高同樣會降低絨毛細度，從而改善絨毛品質，從而發明了KAP26.1基因作為引入絨山羊細胞改善絨毛細度的外源基因的應用，將KAP26.1基因過表達慢病毒注射雄性遼寧絨山羊睪丸，通過病毒感染將KAP26.1基因作為外源基因引入絨山羊細胞之后選育K26.1基因表達量高的遼寧絨山羊個體作為種羊，進而可改善絨山羊絨毛細度，提高絨毛品質。
【專利說明】KAP26.1基因作為引入絨山羊細胞改善絨毛細度的外源基
因的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種KAP26.1基因的新用途，尤其是一種KAP26.1基因作為引入絨山羊細胞改善羊絨細度的外源基因的應用。

【背景技術】
[0002]絨山羊毛被含有粗毛和絨毛，粗毛由初級毛囊產生，而絨毛(山羊絨)由次級毛囊產生。絨毛具有纖細、輕盈、滑柔、保暖、光澤柔和、富有彈性、紡織性能優良等其他纖維無法比擬的特性，是世界紡織工業生產最珍貴的天然纖維原料，素有“軟黃金”的美譽。提高絨毛品質和增加絨毛產量是提高絨山羊經濟價值的兩項主要指標，而絨毛細度又是衡量絨毛品質的主要指標，即絨毛越細，質量越優。2011年，金梅等人發現遼寧絨山羊中存在基因K26，KAP8.2，KAP7.1,KAPl1.1，KAP26.1等，這些基因屬于高甘氨酸/酪氨酸型角蛋白(K26)和角蛋白關聯蛋白(HGT-KAPs)，主要分布于絨山羊皮膚細胞中。本領域技術人員都知道，外源基因是通過基因工程技術或病毒感染等途徑引入靶細胞中的DNA序列，但是，迄今為止，還沒有關于以KAP26.1基因為外源基因通過基因工程技術或病毒感染等途徑引入絨山羊細胞，以改善羊絨細度的相關報道。


【發明內容】

[0003]本發明是發現了 KAP26.1基因對遼寧絨山羊絨細度產生調控作用，即KAP26.1基因表達量越高，則絨毛細度越小；同時，KAP26.1基因的高表達會促使K26，KAP7.1, KAPl1.1等基因的表達量增高，這些基因的增高同樣會降低絨毛細度，從而改善絨毛品質，從而發明了 KAP26.1基因作為引入絨山羊細胞改善絨毛細度的外源基因的應用。
[0004]本發明是以KAP26.1基因為外源基因，構建遼寧絨山羊KAP26.1基因的慢病毒過表達載體并經病毒包裝，形成KAP26.1基因過表達慢病毒。將KAP26.1基因過表達慢病毒注射雄性遼寧絨山羊睪丸，通過病毒感染將KAP26.1基因作為外源基因引入絨山羊細胞。之后選育K26.1基因表達量高的遼寧絨山羊個體作為種羊，進而可改善絨山羊絨毛細度，提聞續毛品質。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0005]圖1是本發明實施例Lent1-EGFP病毒感染羊原代皮膚細胞的不同MOI值照片。
[0006]圖2 是 KAP26.1 慢病毒過表達載體(pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP)菌落 PCR 鑒定電泳圖。
[0007]圖3是KAP26.1慢病毒過表達載體(pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP)酶切鑒定電泳圖。
[0008]圖4是KAP26.1基因過表達慢病毒(Lenti-KAP26.1-IRES-EGFP)慢病毒滴度測定結果圖。
[0009]圖5是目的基因KAP26.1過表達慢病毒的表達柱形圖。
[0010]圖6是KAP26.1基因過表達慢病毒毒液感染羊皮膚細胞熒光檢測照片。
[0011]圖7是本發明實施例KAP26.1基因過表達后羊皮膚細胞中相關基因表達量示意圖。
[0012]圖8是本發明實施例KAP26.1基因在羊毛囊興盛期相對定量柱形圖。
[0013]圖9是本發明實施例KAP26.1基因在羊毛囊退行期相對定量柱形圖。

【具體實施方式】
[0014]1.遼寧絨山羊原代皮膚細胞培養
(1)在遼寧絨山羊一側的臀部選取大約5cm2的地方，用羊毛剪剪去長的毛和絨，碘酒消毒，然后用75%的酒精脫典后，用刀片割取約0.5cm3大小的組織塊，并立即放入75%的酒精中，清洗30s，用含100U/ml雙抗的生理鹽水沖洗三次，最后將羊皮組織塊放入D-Hanks中，封口膜封口，于4°C保存并于4h內帶回實驗室。
[0015](2)把羊皮膚小塊置于含有D-Hanks緩沖液中，用D-Hanks液漂洗三次，然后用眼科剪剪切成Imm3左右的小組織塊。取組織小塊置于培養瓶均勻分布在培養瓶底部。擺布完成后，瓶底向上，于37°C，5%C02培養箱中培養2-3h后，待小塊微干涸。干涸后，加入含20%FBS的DMEM培養基10ml，將培養瓶置于37°C，5%C02培養箱中靜置5-7天，待有細胞從組織塊中游出后增加培養液繼續培養。再2-3天后可去除組織塊和死細胞，加入新鮮的培養基繼續培養。
[0016](3)細胞傳代培養:細胞布滿瓶底70%-80%左右時可傳代培養。去除原培養基，加入D-Hanks沖洗3次，吸出緩沖液，加入含0.02%EDTA的0.25%胰酶1ml，培養箱中培養Imin左右后取出，鏡檢，細胞松動變圓，加入2倍胰酶體積的10% FBS的DMEM培養基終止消化。用移液槍吹打，吹打結束后，將細
胞轉移到離心管中，1000 r/min離心2min。吸去上清液。將2ml含20%FBS的DMEM培養基注入到離心管中，吹打均勻后，平分到兩個培養瓶中，最后補加適量的20%FBS的DMEM培養基，放入培養箱中培養，一般在2天左右細胞就會貼壁。
[0017]2.確定遼寧絨山羊原代皮膚細胞的慢病毒感染最佳MOI值
利用滴度為1.0X 108TU/ml的Lent1-EGFP NC陰性病毒液，Lent1-EGFP病毒購自invitrogen公司，檢測慢病毒的最佳感染復數即MOI值，實驗方法如下:
(1)用0.25%胰酶將皮膚細胞消化lmin，吹打均勻，制成細胞懸液，血球計數板計數并計算細胞的密度。將3000個左右細胞接種到96孔板中，培養基充至120ul，封口，于37°C、5%C02培養過夜；
(2)培養第二天，細胞的匯合度最好為30%-50%，此時準備感染；
(3)感染羊原代細胞的MOI值的范圍在f200之間，因此本實驗將MOI值設定梯度為:
.O,1，10,30,50,100 ；
(4)將相應滴度的Lent1-EGFPNC陰性病毒液依次加入皮膚細胞中，同時加入Polybrene助染劑5ug/ml，增強病毒的感染效果。將細胞放入培養箱中繼續培養12h，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態:病毒以及Polybrene助染劑對細胞沒有產生明顯的毒性作用，則將細胞放回培養箱中繼續培養，并在24h后更換新的20%FBS的DMEM培養基；(5)在感染后72h，將細胞置于熒光顯微鏡下，觀察96孔板中各孔內的綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況，拍照記錄，計算各MOI值下的感染效率，選擇感染效率達到80%以上的最佳MOI值。具體結果見圖1。圖1是10倍物鏡鏡檢照片，A為MOI=O組，B為MOI=1組，C 為 MOI=1 組，D 為 M0I=30 組，E 為 M0I=50 組，F 為 MOI=10 組，1，2 為添加 Polybrene 組，3,4為未添加Polybrene組。
[0018]通過實驗結果發現,添加polybrene能明顯促進病毒的感染效果,但同時還會發現對細胞有一定的毒副作用，會產生抑制細胞的增殖和細胞形態發生變化的副作用。因此，本實驗的最佳MOI值選取30，并添加polybrene助染劑增強感染效率。
[0019]3.獲得KAP26.1基因的PCR產物，建立KAP26.1慢病毒過表達載體pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP
(1)引物設計
根據KAP26.1基因CDS區序列設計合成18條寡聚核苷酸片段，基因3’端添加NheI酶切位點，5’端添加BamHI酶切位點。
[0020](2)基因全長PCR擴增
將所合成的寡居核苷酸序列片段按每相鄰的4條進行PCR擴增。剩余的寡居核苷酸序列片段依次進行。取2ul PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。如果發現PCR產物出現雜帶，則需進行切膠回收。第二輪PCR:第一輪PCR產物作為第二輪PCR模板，拼接KAP26.1全長基因。第三輪PCR:以第二輪PCR產物作為第三輪PCR模板，根據基因的首尾引物對基因全長進行擴增。
[0021](3)目的基因PCR產物及目的載體的酶切
將目的基因PCR產物和目的載體(Plenti6.3-MCS-1RES-EGFP)用BamHI和NheI分別進行雙酶切。37°C酶切4-5h后，電泳分離酶切片段，切膠回收目的片段。
[0022](4)目的片段與目的載體的連接
T4 DNA Iigase連接上述酶切后的PCR產物及目的載體。將1ul的連接產物轉化到DH5a感受態細胞中，涂布于含有氨芐的抗性LB平皿上，37° C培養過夜。第二天，挑取平板上的單菌落進行菌落PCR。
[0023]菌落PCR后，將PCR呈陽性的克隆接到LB液體培養基中，37°C搖菌過夜，第二天進行抽提質粒。菌落PCR呈陽性抽提出的質粒進行酶切鑒定。最后將菌落PCR和酶切鑒定均呈陽性的克隆送測序，并進行序列比對(見圖2，3)，得到測序正確的pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP。
[0024]圖2 中泳道 1:Marker DL5000 (從上到下分別為 5000，3000，2000，1500,1000,750，500，250，10(^?)，泳道2:陰性對照(水)，泳道3-10:K26-F1/ K26-R引物對重組子PCR擴增；
圖 3 中泳道1 =Marker DL5000(從上到下分別為 5000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，10bp),泳道2和3 =PacI和AscI酶對重組載體質粒進行雙酶切。
[0025]4.制備KAP26.1基因過表達慢病毒
(l)將測序正確的pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP菌液劃線培養后，挑單克隆菌接入30ml含氨芐的LB培養基中，37°C搖菌過夜。然后利用AXYGEN質粒抽提試劑盒進行質粒抽提。將質粒DNA最終溶于除菌的TE緩沖液中，用Thermo Nanodrop儀器檢測質粒濃度和純度。
[0026](2) 293T 細胞準備
在轉染前一天，將生長狀態良好的293Τ細胞棄掉舊培養液后，加入2 ml PBS溶液，使PBS洗滌細胞得生長面后棄去PBS溶液。每個培養皿中加入I ml0.25%胰酶消化液，制作細胞懸液，重懸均勻。將細胞傳至被多聚賴氨酸(PDL)包被的1cm培養皿中，一共傳20個培養皿，再向每皿中加入7 ml 10% FBS的DMEM培養基，于37 °C、5% CO2細胞培養箱中繼續培養約24h。
[0027](3)慢病毒包裝
轉染時，向滅菌的50ml離心管中加入1ml Opt1-ΜΕΜ,加入表達質粒(pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP) 120ug 和包裝質粒(Plenti6.3-MCS-1RES-EGFP) 120ug,混合均勻后，室溫下孕育5min。然后向另一支滅菌的50ml離心管中加入1ml Opt1-MEM，加A POLOdeliverer ? 3000 Transfect1n Reagent 480ul,輕輕混勻后，室溫下溫育 5 min。接著把稀釋后的DNA和稀釋后的POLOdeliverer ? 3000 Transfect1n Reagent混合后輕輕顛倒混勻，室溫下孵育20min。以形成DNA與POLOdeliverer ? 3000 Transfect1nReagent混合復合物。在293T細胞中滴加Iml上述混合復合物，于37 V , 5% CO2中培養。
[0028](4)病毒收獲和濃縮
在轉染后48 h，進行第一次收液，收集293T細胞上清液于4 °C暫存。然后把細胞更換新鮮的完全培養基，繼續培養至72-80h，進行第二次收液，收集293T細胞上清，并與第一次收集的混合，共計300ml。將收集的病毒于4 0C, 3000 rpm離心10 min,以除去細胞碎片。用0.45 μ m濾器過濾上清液于Beckman SW28離心管中。每個離心管中裝36ml病毒，4° C,22000rpm離心2h。離心完畢后，小心取出離心管，棄掉上清液，每管用130ul的預冷DMEM基本培養基溶解沉淀。待病毒沉淀溶解完全后，收集到1.5ml離心管內，10ul/管分裝，于-80° C保存。
[0029](5)熒光顯微鏡觀察法測定慢病毒滴度
感染前，用胰酶消化細胞并計數，將5X10 5細胞/ml的293T細胞接種24孔板中，每孔0.5ml。第二天，根據病毒的預期滴度，10倍倍比稀釋慢病毒濃縮液。例如:15 ul慢病毒原液加入135 ul DMEM配成KT1病毒液，15 ul KT1病毒液加入135 ul DMEM配成10 2病毒液，以上述方法配置10 3病毒液和10 4病毒液。加入病毒液之前將細胞換新鮮培養基，每孔內加入400ull0%FBS的DMEM培養基，除了 control組外其余各孔均加入polybrene助染劑至終濃度為8 ug/ml。再向各感染孔內分別加入相應稀釋度的病毒液及病毒原液各100ul，于37°C、5% CO2培養箱內培養。在感染24小時后，將細胞換新鮮培養基，每孔內加入500ull0% FBS的DMEM含有1% P/S和l%Glutamax，然后繼續放回培養箱內進行培養。在感染48h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，照相。選取合適的稀釋度所對應的孔，對GFP陽性的細胞進行計數，并依此計算待測慢病毒的滴度(見圖4)。
[0030]圖4中A、B為未感染細胞對照組，C、D為10 ―1病毒液感染組，E、F為10 -2病毒液感染組，G、H為10 -3病毒液感染組，1、J為10 -4病毒液感染組。
[0031](6)病毒液目的基因KAP26.1檢測
將處于對數期的293T細胞用0.25%胰酶消化lmin，吹打均勻，制成細胞懸液。將細胞接種到12孔板中，于37°C 5%C02培養箱培養，待細胞融合度達50%左右。在各孔中分別加入20ul目的病毒液(KAP26.1病毒液)及對照病毒液(Lent1-EGFP NC病毒液)，同時加入8ug/ml的Polybrene助染劑，促進感染。感染72h后，在熒光顯微鏡下觀察目的基因慢病毒GFP的表達情況，并拍照記錄感染結果。棄掉細胞的培養基，抽提RNAJf RNA反轉錄成cDNA。然后進行熒光定量檢測，用ΛΛ Ct法對各基因進行相對定量。
[0032]經計算KAP26.1基因過表達慢病毒(Lenti-KAP26.1-1RES-EGFP)的滴度為:
8.32X 107Tu/mlo感染293T細胞后，熒光定量結果顯示KAP26.1的表達量為NC對照組的70549.68 倍(見圖 5)。
[0033]5.KAP26.1基因過表達后羊皮膚細胞中相關基因表達qPCR檢測
KAP26.1目的病毒及NC陰性對照慢病毒感染羊皮膚細胞，過程如下:將細胞用0.25%的胰酶消化后，制成細胞懸液接種于6培養板中，于37°C 5%C02培養箱培養。根據MOI值的檢測，向細胞中加入適宜病毒滴度的病毒液的目的病毒和陰性對照病毒液，同時在培養板的各孔中加入8ug/ml的Polybrene助染劑。感染8h后更換無慢病毒病毒液的20%FBS的DMEM培養基繼續培養。感染72h后，在熒光顯微鏡下觀察目的基因慢病毒GFP的表達情況，拍照記錄感染結果(見圖6)。從病毒感染后的羊皮膚細胞中抽提總RNA。RNA反轉錄成cDNA。然后進行Real-time PCR,結果用ΛΛ Ct法進行各基因表達的相對定量。
[0034]圖6顯示的是KAP26.1基因過表達慢病毒轉染對數期的羊原代皮膚后，在熒光倒置顯微鏡下的照片。A、B為未感染慢病毒細胞空白對照組；C、D為NC慢病毒感染靶細胞組；E、F為KAP26.1目的慢病毒液感染靶細胞;A，C，E為在光學鏡下的照片；B，D，F為熒光鏡下的照片。
[0035]KAP26.1基因過表達后羊皮膚細胞中相關基因表達量見圖7。表明KAP 26.1基因過表達后，KAP 7.1和KAP11.1顯著過表達(P〈0.01), KAP 8.2，K26基因則無顯著變化。
[0036]對KAP 7.1和KAP11.1進行各時期初次級毛囊的表達含量的研究結果，這兩個基因在興盛期時次級毛囊的表達含量明顯高于初級毛囊，對絨毛的細度起正調控作用。本發明使KAP26.1過表達后，能明顯增加KAP 7.1和KAP11.1基因的表達量，使絨毛變細。
[0037]在遼寧絨山羊毛囊興盛期，以內參基因β -actin作為對照，KAP26.1在次級毛囊中的表達較初級毛囊更為活躍，KAP26.1在次級毛囊中的表達量是初級毛囊的4.74倍。從結果中可以得出，KAP26.1基因在初次級毛囊中的表達差異極顯著(p〈0.01)，如圖8所示。
[0038]而在遼寧絨山羊毛囊退行期，這個基因在初次級毛囊中的表達趨勢與興盛期相反，KAP26.1在初級毛囊中的表達量是次級毛囊中的3.84倍，其表達差異極顯著(p〈0.01)，如圖9所示。
[0039]說明:實時熒光定量PCR的檢測結果顯示，在遼寧絨山羊毛囊興盛期、退行期初次級毛囊中以及毛囊休止期皮膚中的內參基因(β -actin)和KAP26.1這個目的基因都得到了較好的擴增曲線和融解曲線，擴增效率較高，并且融解曲線峰形單一，說明反應特異性好，從而證明了該實驗數據可用。
[0040]6.5X105TU KAP26.1基因過表達慢病毒注射睪丸的成年雄性遼寧絨山羊并選KAP26.1高表達的成年雄性遼寧絨山羊為種羊，培育絨毛品質優良的遼寧絨山羊
首先將KAP26.1基因過表達慢病毒注射成年雄性遼寧絨山羊睪丸，之后在其中選KAP26.1高表達的成年雄性遼寧絨山羊為種羊作為實驗組，正常成年種羊作為對照組，對后代各組絨山羊的絨細度及絨產量等指標進行檢測，結果見表1與表2。
[0041]表1絨山羊KAP26.1高表達實驗組生產性能平均測試指標

【權利要求】
1.一種 KAP26.1基因作為引入絨山羊細胞改善絨毛細度的外源基因的應用。
【文檔編號】C12N15/867GK104099371SQ201410342823
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】金梅, 趙鳳琴, 樸敬愛, 樸君, 李秀娜 申請人:遼寧師范大學