干細胞的產生和保持的制作方法
【專利摘要】本發明提供通過在存在ALK5抑制劑時培養細胞而產生并且保持多能細胞。
【專利說明】干細胞的產生和保持
[0001]本申請是國際申請號PCT/US2009/068274，國際申請日為2009年12月16日，中國國家申請號為200980156917.8，發明名稱為“干細胞的產生和保持”的分案申請。
[0002]發明背景
[0003]盡管從1981年就已經由小鼠建立了胚胎干細胞(ESCs)，但是由各種其它哺乳動物(包括大鼠)衍生它們的對應體的嘗試尚未成功。近來，從小鼠和大鼠的植入后卵圓柱期上胚層衍生了多能干細胞(Brons等，Nature (自然)448,191-195 (2007) ;Tesar等，Nature (自然)448，196-199 (2007))。這些新型的干細胞被命名為上胚層干細胞(EpiSCs)。在群落形態和對保持多能性的培養/信號傳導需要方面，EpiSCs似乎非常接近地對應于人胚胎干細胞(hESCs)，但是表現出一定范圍的與小鼠ES細胞(mESCs)不同的顯著的表型和信號傳導反應差異。
[0004]白血病抑制因子(LIF)是在存在血清的條件下通過JAK-STAT3途徑保持mESCs多能性所必需的(Niwa等，Genes Dev (基因發育)12，2048-2060 (1998))。然而，在不含血清的培養基中，還需要BMP4，以及LIF，以通過誘導分化(Id)蛋白表達的抑制劑(Ying等，Cell (細胞)115,281-292(2003))和抑制 ERK 激活(Qi 等，Proc Natl Acad Sci U SA(美國國家科學院學報)101,6027-6032(2005))來保持mESC的自我更新。與mESCs相反，LIF不能支持EpiSCs/hESCs，其典型地需要堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)/激活蛋白A(Activin A)進行長期的自我更新。未分化的hESCs通過bFGF信號傳導表現出高水平的基本 ERK 活性(Dvorak 等，Stem Cells (干細胞)23，1200-1211 (2005))。BMP4 也不支持EpiSC/hESC自我更新，但是相反誘導EpiSC/hESC分化成滋養層或原始內胚層(Bixms等，Nature (自然)448，191-195 (2007) ；Tesar 等，Nature (自然)448，196-199 (2007)；Xu 等，Nat B1technol(自然生物技術)20，1261-1264(2002))。除了 bFGF 之外，已經表明激活蛋白A/Nodal信號傳導支持hESCs/EpiSCs的未分化狀態(Brons等，Nature (自然)448，191-195(2007) ;Sato 等，Dev B1l (發育生物學)260，404-413 (2003) ;Tesar 等，Nature (自然)448，196-199 (2007))，而對于mESCs不是必要的。這些結果強烈支持下述觀點=EpiSCs和hESCs本質上是相似的，并且提出一種吸引人的假說，即，mESCs和EpiSCs/hESCs代表兩種不同的多能狀態:表示植入前內細胞群(ICM)的mESC-樣狀態，和表示后期上胚層細胞的EpiSC-樣狀態。
[0005]mESCs通常可以使用基于滋養層的細胞培養條件而來源于某些小鼠品系(Martin, G.R.,Proc Natl Acad Sci U S A (美國國家科學院學報)78，7634-7638 (1981))。然而，已經證明在相似條件下很難由大鼠衍生真正的ES細胞。已經報道了大鼠ESC-樣細胞的建立(Demers 等,Clonin g Stem Cells (克隆干細胞)9, 512-522 (2007) ;Ruhnke 等，StemCells(干細胞)21,428-436(2003) ;Schulze 等，Methods Mol B1l (分子生物學方法)329，45-58(2006) ;Ueda等，PLoS 0NE3, e2800 (2008))，但是這些細胞不能穩定地保持或者缺少真正的體內多能性(例如，不能形成畸胎瘤或對嵌合體沒有/有很少的貢獻)。類似地，盡管已經衍生了(體外)多能性大鼠EpiSCs，但是大鼠和小鼠EpiSCs都表現出很少的能力或沒有能力再結合到植入前的胚胎中并且形成嵌合體(Brons等，Nature (自然)448,191-195(2007) ;Tesar 等，Nature (自然)448，196-199 (2007))。
[0006]最近，通過確定的遺傳轉導由小鼠和人體細胞產生的誘導的多能干細胞(iPSCs)吸引了眾多興趣(Dimos 等，Science (科學)321,1218-1221 (2008) ；Han, J.，和 Sidhu，K.S.Curr Stem Cell Res Ther (現代干細胞研究和治療)3，66-74 (2008) ；Takahashi等，Cell (細胞)131,861-872(2007) ；Takahashi, K.，和 Yamanaka，S.，Cell (細胞)126，663-676 (2006) ；Yu 等，Science (科學)318，1917-1920 (2007))。
[0007]發明簡述
[0008]本發明提供經過至少一次細胞分裂培養多能細胞的方法。在一些實施方案中，所述方法包括在充足量的:
[0009]a.ALK5抑制劑(或其它TGF β /激活蛋白途徑抑制劑)，和
[0010]b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；和
[0011]c.充分的營養足夠的時間；
[0012]存在時培養多能動物細胞，以允許至少一次細胞分裂同時保持細胞的多能性。
[0013]在一些實施方案中，所述培養步驟還包括在存在一定量的GSK3 0抑制劑時培養細胞。在一些實施方案中，所述GSK3 0抑制劑是CHIR99021。
[0014]在一些實施方案中，所述第二化合物是MEK抑制劑。在一些實施方案中，所述MEK抑制劑是Η)0325901。
[0015]在一些實施方案中，所述第二化合物是Erk抑制劑。
[0016]在一些實施方案中，所述培養步驟在還存在白血病抑制因子(LIF)時進行。
[0017]在一些實施方案中，所述ALK5抑制劑是A-83-01。在一些實施方案中，所述ALK5抑制劑是SB431542。
[0018]在一些實施方案中，所述多能細胞通過至少5次細胞分裂培養同時保持細胞多能性。
[0019]在一些實施方案中，所述方法還包括向所述多能細胞中引入異源核酸，并且培養所得到的細胞，以允許至少一次另外的細胞分離，同時保持多能性。在一些實施方案中，將異源核酸引入到動物細胞中，然后誘導多能性，再然后進行培養步驟。
[0020]在一些實施方案中，所述細胞是大鼠細胞或人細胞。在一些實施方案中，所述細胞是靈長類、羊、牛、貓、狗、或豬的細胞。
[0021]在一些實施方案中，所述多能細胞是胚胎干細胞。在一些實施方案中，所述多能細胞是誘導的多能干細胞。
[0022]在一些實施方案中，所述細胞是非人動物細胞，并且所述方法還包括將所述多能細胞引入到胚泡中，其中所述胚泡與所述細胞來自相同的動物物種，并且將所述胚泡引入到相同物種的動物的子宮內。在一些實施方案中，所述方法還包括基于來自所述多能細胞的核酸的存在而選擇所述動物的嵌合后代。
[0023]本發明還提供多能哺乳動物細胞的培養物。在一些實施方案中，所述培養物包括充足量的下述:
[0024]a.ALK5抑制劑(或其它TGF β /激活蛋白途徑抑制劑)，和
[0025]b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；
[0026]以允許至少一次細胞分裂，同時保持細胞多能性。
[0027]在一些實施方案中，所述培養物還包括LIF。
[0028]在一些實施方案中，所述培養物還包括一定量的GSK3 0抑制劑。在一些實施方案中，所述GSK3 0抑制劑是CHIR99021。
[0029]在一些實施方案中，所述第二化合物是MEK抑制劑。在一些實施方案中，所述MEK抑制劑是Η)0325901。
[0030]在一些實施方案中，所述第二化合物是Erk抑制劑。在一些實施方案中，所述ALK5抑制劑是A-83-01。在一些實施方案中，所述ALK5抑制劑是SB431542。
[0031]在一些實施方案中，所述細胞是大鼠細胞或人細胞。在一些實施方案中，所述細胞是靈長類動物、綿羊、牛、貓、狗、或豬的細胞。在一些實施方案中，所述細胞是誘導的多能干細胞或胚胎干細胞。
[0032]本發明還提供一種細胞培養基。在一些實施方案中，所述培養基包括充足量的下述:
[0033]a.ALK5抑制劑(或其它TGF β /激活蛋白途徑抑制劑)，和
[0034]b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；
[0035]從而在所述培養基中培養多能細胞時，允許至少一次細胞分裂，同時保持細胞多能性。
[0036]在一些實施方案中，所述培養基還包括LIF。
[0037]在一些實施方案中，所述培養基還包括一定量的GSK3 β抑制劑。在一些實施方案中，所述GSK3 0抑制劑是CHIR99021。
[0038]在一些實施方案中，所述第二化合物是MEK抑制劑。在一些實施方案中，所述MEK抑制劑是Η)0325901。
[0039]在一些實施方案中，所述第二化合物是Erk抑制劑。在一些實施方案中，所述ALK5抑制劑是A-83-01。在一些實施方案中，所述ALK5抑制劑是SB431542。
[0040]在一些實施方案中，所述培養基在預先包裝的、密封容器中。在一些實施方案中，所述培養基包括DMEM或其它對生長人、大鼠、小鼠或其它動物的細胞相容的培養基。
[0041]本發明還提供分離的多能動物細胞，所述細胞在存在白血病抑制因子(LIF)和骨形態發生蛋白(BMP)時，或在抑制TGFii和激活蛋白信號傳導途徑，抑制MAPK信號傳導途徑，和任選地抑制FGF途徑時，進行復制并且保持多能性。在一些實施方案中，所述分離的多能動物細胞不是鼠胚胎干細胞(mESC)。在一些實施方案中，所述細胞是人細胞。在一些實施方案中，所述細胞是人iPS細胞。在一些實施方案中，所述細胞是大鼠細胞。在一些實施方案中，所述細胞是大鼠胚胎干細胞。在一些實施方案中，所述細胞是大鼠iPS細胞。在一些實施方案中，所述細胞在抑制ALK5和MEK時保持多能性。在一些實施方案中，所述細胞包括異源表達盒，其包括但不限于，編碼可選擇或可檢測的標記(例如，堿性磷酸酶)的表達盒。
[0042]與常規培養的hESCs、上胚層干細胞和人誘導的多能細胞相比，本發明的分離的多能細胞表達更高水平的E-1丐粘著蛋白(E-cadherin)。例如，與常規培養的hESCs、上胚層干細胞和人誘導的多能細胞相比，所述分離的多能動物細胞表達2倍更高水平的E-鈣粘著蛋白。在一些實施方案中，與常規培養的hESCs、上胚層干細胞和人誘導的多能細胞相比，所述分離的多能動物細胞表達更高水平的標記，其中所述標記包括Gbx2，Dppa3，Klf4，和Rexl。
[0043]在一些實施方案中，在存在ALK5抑制劑，存在選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑的第二化合物時，培養本發明所述分離的多能細胞。在一些實施方案中，本發明的分離的多能細胞通過在存在ALK5抑制劑，和選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、P38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種的第二化合物時培養所述細胞獲得或可通過在存在ALK5抑制劑，和選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種的第二化合物時培養所述細胞獲得。例如，本發明的分離的多能細胞通過培養常規培養的EpiSCs、大鼠ESCs、或靈長類動物ESCs而獲得或可通過培養常規培養的EpiSCs、大鼠ESCs、或靈長類動物ESCs而獲得。
[0044]本發明還提供了增加部分多能哺乳動物細胞的多能性至更加完全多能的細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括:
[0045](a)使所述部分多能細胞與外遺傳修飾劑接觸，所述外遺傳修飾劑選自組蛋白脫乙酰酶抑制劑、組蛋白H3K4去甲基化抑制劑或H3K4甲基化激活劑；
[0046](b)在步驟(a)后，在不存在所述外遺傳修飾劑時和用下述中的兩種或多種培養所述細胞:(i)ALK5抑制劑，(ii) MEK抑制劑，Erk抑制劑，或p38抑制劑，和(iii)FGF受體抑制劑，由此產生比所述部分多能哺乳動物細胞更加完全多能的細胞。
[0047]在一些實施方案中，所述方法還包括:
[0048](c)在步驟(b)后用下述培養所述部分多能哺乳動物細胞:(i)ALK5抑制劑，(ii)MEK抑制劑，Erk抑制劑，或p38抑制劑，和(iii) FGF受體抑制劑和(iv)GSK3抑制劑。
[0049]在一些實施方案中，培養步驟(a)和/或(b)和/或(C)還包括在存在白血病抑制因子(LIF)時培養所述部分多能哺乳動物細胞。
[0050]在一些實施方案中，所述部分多能細胞是上胚層干細胞。
[0051]在一些實施方案中，所述部分多能細胞不表達至少一種下述標記，所述標記選自由0ct4，Nanog，SSEA-UP REX-1組成的組，并且所述更加完全多能的細胞表達一種或多種或所有所述標記。
[0052]在一些實施方案中，所述部分多能細胞不表達ALP-1，并且所述更加完全多能的細胞表達ALP-1。
[0053]在一些實施方案中,所述外遺傳修飾劑是丙戍酸或硫酸反苯環丙胺(parnate)。
[0054]附圖簡述
[0055]圖1.mESC-樣riPSCs可以由通過反轉錄病毒轉導0ct4, Sox2和Klf4后的大鼠WB-F344 細胞產生，并且在 LIF，0.5μΜ PD0325901,0.5 μ M Α-83-01 和 3μΜ CHIR99021 的組合下捕獲/保持。在轉導后10天觀察到ESC-樣的群落(A)，但是不能在常規mESC培養條件下保持(B)。在存在0.5 μ M PD0325901和3 μ M CHIR99021時，riPSCs可以短期保持在培養物中但是表現出廣泛的自發性分化(C)。使用0.5μΜ PD0325901,3yM CHIR99021,和0.5μΜ Α-83-01的組合，riPSCs可以長期且同質自我更新(D)，并且在培養物中形成mESC-樣圓頂群落(E)。免疫細胞化學揭示riPSCs表達典型的mESC標記，諸如0ct4(F)，Sox2 (G)，SSEA-1 (H，綠色)和Nanog (H，紅色)。4個克隆的riPSC株系的RT-PCR分析證實內源性典型多能標記的表達(I)，但是病毒轉導的基因在很大程度上被沉默。riPSC克隆的0ct4啟動子表現出去甲基化模式并且與親本WB-F344細胞的模式明顯不同(J)。
[0056]圖2.riPSCs在體外和體內具有多能發育潛能。免疫染色顯示riPSCs在體外可以分化成內胚層(白蛋白和Pdxl) (A和B)，神經外胚層(β II1-微管蛋白，Tujl) (C)和中胚層(Brachyury) (D)衍生物。并且，在SCID小鼠中，riPSCs可以形成畸胎瘤，所述畸胎瘤由所有三個胚層組成(E~H)。另外，在注射到Brown-Norway大鼠胚泡中后，具有WB F344背景的riPSCs能夠產生嵌合體大鼠(I)。相對放大倍率:A~E(100X)，F~H和J~Q(200X)。
[0057]圖3.產生新型“mESC-樣’liPSCs。將MR90人成纖維細胞通過慢病毒轉導0ct4，Sox2, Nanog，和Lin28。轉導后3周觀察到hiPSC群落(A)，在轉導后第4周挑取群落并且穩定保持在hLIF，0.5μΜ PD0325901,0.5μΜ Α-83-01，和 3μΜ CHIR99021 的混合物中。這樣的hiPSCs與mESCs類似形成圓頂群落(B)。在這樣的條件下，hiPSCs對ALP(C)和其它典型的多能標記(D~I)是陽性的。4個克隆的riPSC株系的RT-PCR分析證實內源性多能基因的表達(J)，但是病毒轉導的基因在很大程度上被沉默。hiPSCs克隆的0ct4啟動子表現出與常規培養的人ES細胞相似的去甲基化模式，但是與親本IMR90成纖維細胞的模式明顯不同⑷。提供了 hiPSCs的核型分析(L)。
[0058]圖4.免疫染色顯示hiPSCs在體外可以有效地分化成內胚層(白蛋白)(A)，神經外胚層(β II1-微管蛋白，TujI) (B)和中胚層(Brachyury) (C)衍生物。在植入到SCID小鼠中后，hiPSCs可以形成畸胎瘤，所述畸胎瘤由所有三個胚層組成，包括神經上皮樣結構(外胚層)(D)，微管樣結構(內胚層)(D)，軟骨樣結構(中胚層)(E)。相對放大倍率:A (100 X)，B ~E(200X)。
[0059]圖5.不同的小分子組合對保持riPSCs在培養中的多能性的作用。將riPSCs胰蛋白酶化為單細胞，并且以103個細胞/孔的密度接種到6-孔板中，并且用不同的抑制劑組合處理。5天后，進行ALP染色以顯現riPSC群落(A)。從10個隨機的40 X視野計數每種條件的ALP陽性群落，并且相對群落數目總結在B中。
[0060]圖6.EpiSCs在mESC生長條件下分化，并且不容易轉化為ICM/mESC-樣狀態。(A)在補充了 LIF的常規mESC生長培養基中，鼠ESCs Rl生長為致密的圓頂群落，并且所述群落表現出陽性ALP活性(上左圖)。在補充了 bFGF的常規hESC培養基中，EpiSCs生長為大而扁平的群落，并且所述群落表現出陰性ALP活性(上右圖)。EpiSCs在補充了 LIF的常規mESC生長培養基中分化(下左圖)；EpiSCs在補充了 LIF和(λ 5μΜ MEK抑制劑Η)0325901，0.1 μ M EGFR 抑制劑 PD173074 與 3 μ M GSK3 抑制劑 CHIR99021 (m/MFGi)的常規 mESC 生長培養基中分化(下右圖)。(B)產生轉化的細胞的示意圖。將EpiSCs胰蛋白酶化成單細胞，并且在mESC自我更新條件下接種到飼養細胞上，補充所示的化學化合物約4天，以誘導轉化，然后再選擇4天。隨后再次平板接種培養物并且進一步選擇和再擴增2周，在該時間過程中挑取穩定的克隆。(C)通過選擇性ALK4/5/7抑制劑A-83-01 (0.5 μ Μ)抑制TGF β信號傳導誘導EpiSCs形成表達ALP的更致密的圓頂群落。(D)這些群落可以在補充了 LIF和0.5μΜ Α-83-01,0.5μ M PD0325901，0.1 μ M PD173074%3yM CHIR99021 (mMFGi)的mESC生長培養基中進一步穩定擴增。(E)LSD抑制劑硫酸反苯環丙胺誘導EpiSCs形成表達ALP的更致密的圓頂群落。這些群落可以在mMFGi或(F)mAMFGi條件下進一步穩定擴增。注意mESC-樣圓頂群落和陽性ALP活性。刻度條，50 μ m。
[0061]圖7.通過用硫酸反苯環丙胺與ALK4/5/7，MEK, FGFR和GSK3的抑制劑處理，EpiSCs轉化為ICM/mESC-樣狀態。(A)由三種類型的化合物-處理的細胞產生嵌合體的效率。(B)在將聚集的胚胎植入到假孕小鼠中后，在成體小鼠中通過硫酸反苯環丙胺/mAMFGi的條件由EpiSCs轉化的穩定的mESC-樣細胞形成嵌合體。野鼠色涂膜色源自硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞。(C)在多個成體組織中存在GFP整合的PCR基因型。⑶通過由用GFP標記的硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞產生的熒光檢查E13.5胚胎，并且在多個胚胎組織中觀察到GFP-陽性細胞(較高分辨率的圖片顯示在圖1OA中)。(E)通過FACS分離性腺中的GFP/SSEA-1雙重陽性細胞，并且通過實時PCR檢驗種系標記。結果證明在硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞-形成的種系譜系中種系標記Blimpl和Stella的特異性表達。條:土STDV。
[0062]圖8.轉化的硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞的分子表征。㈧免疫細胞化學表明多能標記0ct4(綠色)，Nanog (紅色)，和SSEA-1 (紅色)在硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞中的均勻表達。(B)通過半定量RT-PCR分析特異性ICM標記基因(Rex-l，Pecaml，Daxl，Dppa5，Esrrb, Fgf4,和 Fbxol5)、種系能力相關的標記基因(germline competence associatedmarker genes) (Stella 和 Stra8)、和 Epiblast 基因(fgf5)在 mESCs, EpiSCs,和硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞中的表達。(C)mESCs，EpiSCs，和硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞的轉錄組(transcriptome)分析表明，與EpiSCs相比,硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞要與mESCs相似得多。兩種生物學復本用于所有三種細胞類型。(D)通過亞硫酸氫鹽基因組測序甲基化分析Stella和Fgf4啟動子。空心圓和實心圓分別表示未甲基化的和甲基化的CpGs。(E)多種細胞中在Stella基因座中所示的組蛋白修飾的ChIP-QPCR分析。用所示的抗體由不含飼養細胞培養的EpiSCs，Rl-mESCs，和硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞免疫沉淀基因組DNAs，然后使用對編碼Stella的內源性基因組基因座特異性的引物組進行Q-PCR分析。將組蛋白修飾的水平表示為插入(input)的百分數。IgG作為無抗體對照。
[0063]圖9.轉化的硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞的功能表征。(A)硫酸反苯環丙胺/mAMFGi具有與mESCs相似的生長速率。將Rl-mESCs和硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞每3天傳代，并且每24小時計數細胞數目。(B)硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞在體外可以有效地分化成三個胚層中的細胞，包括特征性的神經細胞(β II1-微管蛋白和MAP2ab陽性的)，心肌細胞(心臟肌鈣蛋白和MHC陽性的)，和內胚層細胞(Soxl7或白蛋白陽性的)。細胞核用DAPI染色。(D)BMP4對在EpiSCs，mESCs，和硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞中引入中胚層標記(Brachyury),滋養層標記(Cdx2),和原始內胚層標記(Gata6)表達有不同的影響。(E)在單層和化學限定的條件下的定向逐步心肌細胞分化表明，硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞與Rl-mESCs共有相似的分化反應，并且與EpiSCs不同。將細胞用CT3染色和搏動表型(beating phenotype)進行表征。
[0064]圖10.硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞有效地形成嵌合體小鼠。(A)來自嵌合體胚胎的組織。在性腺、腦、心臟、腸、肺和腎中觀察到由硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞形成的GFP陽性細胞。⑶嵌合體成體小鼠的GFP基因型。隨機挑選5只小鼠，并且通過基因組PCR分析在5種不同的組織，即，心臟、肺、肝、腦、和脾中的GFP整合。在2只成體小鼠的所有5種組織，在3只小鼠的4種組織中的GFP整合的陽性檢測，證實硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞在體內可能形成三個胚層(中胚層、內胚層和外胚層)。
[0065] 圖11.在有飼養細胞或無飼養細胞的條件下，多能標記在轉化的硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞中的均勻表達。(A)將硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞用GFP標記，并且在飼養細胞上增殖。免疫染色結果表明GFP和多能標記0ct4 (紅色)，Nanog (紅色)，和SSEA-1 (紅色)的均勻表達。(B)由單一的硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞發育未分化的0ct4-陽性群落與由單一的0G2-ES細胞發育一樣有效。在不含飼養細胞和N2B27-化學限定的條件下進行單細胞接種后，將群落擴增幾代。刻度條，50ym。(C)在不存在LIF時，硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞分化并且失去0ct4表達。在不含飼養細胞和N2B27-化學限定的條件下進行單細胞接種后，硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞擴增；顯示補充生長因子。
[0066]圖12.在轉化的硫酸反苯環丙胺/mAMFGi細胞和Rl_mESC細胞中檢測到STELLA表達，但是在EpiSCs中沒有檢測到。免疫染色結果顯示STELLA和DAPI的表達。
[0067]定義
[0068]術語“多能”或“多能性”指具有產生這樣的后代的能力的細胞，所述后代能夠在適當條件下經歷分化成為共同展示與來自全部三胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的細胞譜系相關的特征的細胞類型。多能干細胞可以形成出生前、出生后或成年動物的許多或全部組織。標準的本領域公認測試，諸如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以用于確定細胞群的多能性，然而，不同多能干細胞特征的鑒定也可以用于檢測多能細胞。細胞多能性是一種連續體，范圍從可以正確形成每種胚胎細胞的完全多能細胞(例如，胚胎干細胞和iPSCs)到不完全或部分多能細胞，所述不完全或部分多能細胞可以形成所有三種胚層，但是可能不表現出完全多能細胞的所有特征，諸如例如，種系傳遞(genmlinetransmiss1n)或產生完整的生物體的能力。在具體的實施方案中，細胞的多能性由不完全或部分多能細胞增加至更加多能的細胞，或者，在某些實施方案中，增加至完全多能細胞。例如，多能性可以通過畸胎瘤形成、種系傳遞、和四倍體配體互補測定。在一些實施方案中，多能性基因或多能性標記的表達，如本文其它地方所討論的，可以用來測定細胞的多能性。
[0069]“多能干細胞特征”意指將多能干細胞與其他細胞相區別的細胞特征。產生能夠在適當條件下經歷分化成為共同展示與來自全部三胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的細胞譜系相關的特征的細胞類型的后代的能力是多能干細胞特征。表達或不表達某些分子標記物組合也是多能干細胞特征。例如，人多能干細胞表達來自以下非限制性列表的標記物中的至少一些，且任選地表達其全部:SSEA_3，SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E,ALP, Sox2, E-鈣粘著蛋白，UTF-1，0ct4，Rexl，和Nanog。與多能干細胞相關的細胞形態學也是多能干細胞特征。
[0070]術語“文庫”，根據其在本領域中的一般用法，用于表示分子集合，其任選地以可以鑒別各成員的方式來組織和/或分類。文庫可以包括，但不僅限于，組合化學藥品文庫，天然產物文庫，和肽文庫。
[0071]“重組”多核苷酸是不以其天然狀態存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包括自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸處于除其天然存在的背景以外的背景中，例如，與其在自然界中典型接近的核苷酸序列分開，或與其典型不接近的核苷酸序列相鄰(或相連)。例如，可以將研究的序列克隆至載體中，或否則與一種或多種另外的核酸重組。
[0072]“表達盒” 指包括啟動子或與編碼蛋白的序列可操作相連的其他調控序列的多核苷酸。
[0073]術語“啟動子”和“表達控制序列”在本文中用于指指導核酸轉錄的核酸控制序列陣列。用于本文中時，啟動子包括接近轉錄起始點的必需核酸序列，諸如在聚合酶II型啟動子的情形中，包括TATA元件。啟動子還任選地包括遠端增強子或阻抑子元件，其可以位于距轉錄起始點多至數千堿基對處。啟動子包括組成型和誘導型啟動子。“組成型”啟動子是在大部分環境和發育條件下有活性的啟動子。“誘導型”啟動子是在環境或發育調節下有活性的啟動子。術語“可操作相連”指核酸表達控制序列(諸如啟動子、或轉錄因子結合位點陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達控制序列指導對應于所述第二序列的核酸轉錄。
[0074]“異源序列”或“異源核酸”，用于本文中時，是來源于與特定宿主細胞異源的來源的序列或核酸，或如果來自相同來源，則由其初始形式進行修飾。因此，細胞中的異源表達盒不是特定宿主細胞內源的表達盒，例如通過與來自表達載體的核酸序列而非染色體DNA相連，與異源啟動子相連，與報道基因相連等。
[0075]術語“試劑”或“測試化合物”指用于本文所述的篩選測定中的任一化合物。試劑可以是，例如，有機化合物，多肽(例如，肽或抗體)，核酸(例如，DNA、RNA、雙鏈、單鏈、寡核苷酸、反義RNA、小抑制RNA、微小RNA、核糖核酸酶等)，寡糖，脂質。通常，本發明篩選方法中使用的試劑具有小于10，000道爾頓，例如，小于8000，6000，4000，2000道爾頓，例如，50-1500，500-1500, 200-2000, 500-5000之間道爾頓的分子量。測試化合物可以采用測試化合物文庫的形式，諸如提供充足多樣性范圍的組合文庫或隨機文庫。測試化合物任選地與融合配偶體，例如靶向化合物，拯救化合物，二聚化合物，穩定化合物，可尋址化合物(addressable compounds),和其他功能結構部分相連。常規地，具有有用特性的新化學個體通過下述來產生:鑒定具有一些理想特性或活性，例如在某些條件下諸如本文中所述的條件下誘導多能性的能力的測試化合物(稱為“前導化合物”)，產生所述前導化合物的變體，和評估那些變體化合物的特性和活性。通常，將高通量篩選(HTS)方法用于所述分析。
[0076]術語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換地用于指采用單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語包括包含已知的核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連鎖的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有與參照核酸類似的結合特性，且其以與參照核苷酸類似的方式代謝。所述類似物的實例包括，但不僅限于，硫代磷酸酯，磷酰胺，甲基膦酸酯(methyl phosphonates)，手性-甲基膦酸酯，2_0_甲基核糖核酸，肽-核酸(PNAs)。
[0077]除非另外指出，特定核酸序列還包括其保守修飾變體(例如，簡并密碼子置換)和互補序列，以及明確指出的序列。特別地，簡并密碼子置換可以通過產生這樣的序列來獲得，在所述序列中，一個或多個所選(或全部)密碼子的第三個位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res.(核酸研究)19:5081 (1991) ；0htsuka等，J.B1l.Chem.(生物化學雜志)260:2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol.Cell.Probes (分子細胞探針)8:91-98 (1994))。
[0078]表達或活性的“抑制劑”、“活化劑”和“調節劑”分別用來指利用關于所述靶蛋白(或編碼多核苷酸)表達或活性的體外和體內測定所鑒定的抑制分子、活化分子或調節分子，例如，配體、激動劑、拮抗劑、及其同系物和模擬物。術語“調節劑”包括抑制劑和活化劑。抑制劑是，例如，抑制所述靶蛋白表達或與之結合，部分或全部阻斷刺激或蛋白酶抑制劑活性，降低、防止、延遲活化，失活，脫敏，或下調所述靶蛋白活性的試劑，例如拮抗劑。活化劑是例如，誘導或活化所述靶蛋白表達或與之結合，刺激、增加、開放、活化、促進、增強活化或蛋白酶抑制劑活性，致敏或上調所述靶蛋白(或編碼多核苷酸)的活性，例如，激動劑。調節劑包括天然存在的和合成的配體，拮抗劑和激動劑(例如，起激動劑或拮抗劑功能的小化學分子、抗體等)。所述關于抑制劑和活化劑的測定包括，例如，將推定的調節劑化合物應用到表達所述靶蛋白的細胞，然后確定對所述靶蛋白活性的功能性作用，如上所述。將用潛在的活化劑、抑制劑、或調節劑處理的包括所述靶蛋白的樣品或測定與無抑制劑、活化劑、或調節劑的對照樣品進行比較，以檢驗作用程度。對照樣品(未用調節劑處理)被賦予100%的相對活性值。當活性值相對于對照為約80%，任選50%或25，10%，5%或1%時，實現所述靶蛋白的抑制。當活性值相對于對照為約110 %，任選150 %，任選200，300 %，400 %，500 %，或1000-3000 %或更高時，實現所述靶蛋白的活化。
[0079]“Oct多肽”指Octomer轉錄因子家族的任一天然存在成員，或其保留與最接近的相關天然存在家族成員相類似的轉錄因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之內)的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結合結構域的多肽，并且可以進一步包括轉錄活化結構域。示范性 Oct 多肽包括,例如，Oct-1, Oct-2, 0ct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8,0ct-9，和Oct-11。0ct3/4(本文中稱為"0ct4 ")，其包含POU結構域，其為在Pit_l，Oct-1, Oct-2,和 uric-86 之間保守的 150 個氨基酸序列。參見 Ryan, A.K.&Rosenfeld,M.G.Genes Dev.(基因發育)11，1207-1225 (1997)。在一些實施方案中，與天然存在Oct多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號NP_002692.2 (人0ct4)或NP_038661.1(小鼠0ct4)列出的那些相比，變體在其整個序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如，0ct3/4)可以來自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動物。一般地，將使用與所操作的細胞物種為相同物種的蛋白。
[0080]“Klf多肽”指Krilppel樣因子(Klfs)家族的任一天然存在成員，含有與果蠅(Drosophila)胚胎模式調控子Kriippel類似的氨基酸序列的鋅指蛋白，或保留與最接近相關的天然存在家族成員相類似的轉錄因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之內)的天然存在的成員的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結合結構域的多肽，并且可以進一步包括轉錄活化結構域。參見，Dang,D.T.,Pevsner, J.&Yang, VW..Cell B1l.(細胞生物學)32，1103-1121 (2000)。示范性 Klf 家族成員包括，Klfl, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5,Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, KlflO, Klfll, Klfl2, Klfl3, Klfl4, Klfl5, Klf 16,Klfl7。發現Klf2和Klf-4是能夠在小鼠中產生iPS細胞的因子，并且相關的基因Klfl和Klf5也能夠在小鼠中產生iPS細胞,雖然效率降低。參見,Nakagawa,等,Nature B1technology (自然生物技術)26: 101-106 (2007)。在一些實施方案中，與天然存在Klf多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號CAX16088 (小鼠Klf4)或CAX14962 (人Klf4)列出的那些相比，變體在其整個序列上具有至少85 %、90 %或95 %的氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如，Klfl，Klf4，和Klf5)可以來自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動物。一般地，將使用與所操作的細胞物種為相同物種的蛋白。就本文中描述的KLF多肽而言，其可以用雌激素-相關受體β (Essrb)多肽替換。因此，意欲對于本文中所述的各種Klf多肽實施方案同等地描述使用Essrb替代Klf4多肽的相應的實施方案。
[0081]“Myc多肽”指Myc家族的任一天然存在成員(參見,例如Adhikary, S.&Eilers,M.Nat.Rev.Mol Cell B1l.(自然分子細胞生物學綜述)6:635-645 (2005))，或其保留與最接近相關的天然存在家族成員相類似的轉錄因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之內)的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結合結構域的多肽，并且可以進一步包括轉錄活化結構域。示范性Myc多肽包括,例如，c-Myc,N_Myc和L-Myc。在一些實施方案中，與天然存在Myc多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號CAA25015 (人Myc)列出的那些相比，變體在其整個序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如，c-Myc)可以來自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動物。一般地,將使用與所操作的細胞物種為相同物種的蛋白。
[0082]“Sox多肽”指SRY-相關的HMG-box (Sox)轉錄因子的任一天然存在成員，其特征在于存在高運動基團(high-mobility group) (HMG)結構域,或其保留與最接近相關的天然存在家族成員相類似的轉錄因子活性(在至少50^,80%,或90%活性之內)的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結合結構域的多肽，并且可以進一步包括轉錄活化結構域。參見，例如，Dang, D.T.，等Int.J.B1chem.Cell B1l.(國際生物化學細胞生物學雜志)32:1103-1121 (2000)。示范性 Sox 多肽包括，例如，Soxl, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5,Sox6，Sox7，Sox8，Sox9，SoxlO，Soxll，Soxl2，Soxl3，Soxl4，Soxl5，Soxl7，Soxl8，Sox-21,和Sox30。已經表明Soxl以與Sox2相似的效率產生iPS細胞，并且還已經表明基因Sox3，Soxl5和Soxl8也產生iPS細胞，雖然其效率略低于Sox2。參見，Nakagawa,等，NatureB1technology (自然生物技術)26:101-106 (2007)。在一些實施方案中，與天然存在Sox多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號CAA83435 (人Sox2)列出的那些相比，變體在其整個序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Sox多肽(例如，Soxl, Sox2, Sox3, Soxl5，或Soxl8)可以來自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動物。一般地，將使用與所操作的細胞物種為相同物種的蛋白。
[0083]發明詳述
[0084]1.介紹
[0085] 本發明基于意外的發現，即，ALK5抑制劑顯著提高細胞的保持，且任選地在細胞中誘導多能性。組合ALK5抑制劑和MAPK抑制劑(例如，MEK抑制劑，Erk抑制劑或p38抑制劑)或組合ALK5抑制劑與FGF途徑抑制劑(例如，FGF受體抑制劑)允許:
[0086]以新的功能特征保持細胞的多能性，所述新的功能特征在下文中定義，并且顯著不同于常規的人胚胎干細胞或先前所述的誘導的多能干細胞(例如，在美國專利號5，843 ；6，200，806 ;和7，029，913中)，并且更類似于mESC特征；和
[0087]例如，與先前已知的保持多能性的方法(例如，包括GSK3和MEK抑制劑-參見W02008/015418)相比，極大地提高細胞的效率和穩定性。實際上，令人驚訝的是，ALK5的抑制劑有效地部分提高多能性的保持，因為本領域目前集中在激動而不是拮抗TGFii途徑從而刺激多能性。參見，例如，WO 2008/056173。
[0088]本發明部分提供細胞培養物，其包含ALK5抑制劑(或其它TGFβ /激活蛋白途徑抑制劑)和MAPK抑制劑或FGF信號傳導途徑抑制劑，任選地包含哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞在存在所述抑制劑的條件下已經是多能性的或將是多能性的或已經被誘導為多能性的。任選地，所述細胞培養物還可以包括GSK3 0抑制劑和/或白血病抑制因子(LIF)。其它培養基成分和條件可以是本領域通常已知的且包括，例如，基本培養基成分，維生素，礦物質等。
[0089]保持細胞為多能性的能力允許以另外將是不可能的多種方式研究和使用所述細胞。例如，多種多能干細胞在培養中迅速分化或死亡，并且因此不允許進行篩選測定、遺傳改造、和其它需要或便利地保持多能性某段時間或經過多次細胞傳代(例如，細胞分裂)的應用。本發明允許人們克服這樣的問題。
[0090]I1.培養物
[0091 ] 提供細胞培養物，其包括ALK5抑制劑(或其它TGF β /激動蛋白途徑抑制劑)，任選地具有MAPK (例如，MEK或Erk或ρ38抑制劑)或FGF信號傳導抑制劑(例如，FGF受體抑制劑)，從而誘導或保持哺乳動物細胞的多能性。在一些實施方案中，用所述抑制劑培養的細胞具有在實施例中所述的特征，包括但不限于，在培養物中形成圓頂群落，表達ESC標記(例如，0ct4, Sox2，和Nanog)，具有幾乎完全的0ct4啟動子去甲基化，表達Rex-1和ALP (例如，在植入后階段的上胚層和EpiSCs中不存在的ESCs和早期上胚層標記)，在體外分化為內胚層、神經外胚層、和中胚層的能力以及體內多能性特征，諸如形成畸胎瘤(例如，在SCID小鼠中)的能力，并且對于非人細胞，當注射到胚泡中并且植入到接受體子宮內時，形成嵌合體后代的能力。此外，在一些實施方案中，培養中的細胞在相同的培養條件中時保持所述特征持續多次細胞傳代，例如，至少1，2，3，4，5，7，10，20，30，或更多代。
[0092]所述細胞培養物可以任選地還包括GSk3 β抑制劑和LIF中的一種或兩種。如在實施例中所解釋的，在一些實施方案中，存在LIF可以提高多能細胞的長期保持(例如，超過10代)，并且因此充足量的LIF可以包含在培養物中，從而允許長期保持多能性。此外，有或無LIF，還可以包括充足量的GSK3 0抑制劑。在一些實施方案中，GSK3 0抑制劑的量足以提高培養效率，即，提高所形成的陽性多能群落的數量。
[0093]每種抑制劑的量可以不同，并且可以取決于精確的培養條件、所用的具體抑制劑、和培養的細胞類型，為最佳優點而確定。在一些實施方案中，本發明的培養物包括0.05-10 μ Μ,例如，0.1-1 μ Μ,例如，0.5 μ M 的 ALK5 抑制劑(例如，Α-83-01，和 0.1 ~20 μ Μ,例如，2~10 μ M SB431542)。本發明人已經發現TGF-β RI激酶抑制劑11 [2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5- 二氮雜萘]可以用作ALK5抑制劑，如本文所述，例如以約1.5 μ M的濃度使用。因此，在一些實施方案中，本發明的培養物包括0.05-20 μ Μ，例如，0.l-ΙΟμΜ的TGF-13RI激酶抑制劑II。在一些實施方案中，本發明的培養物包括10ηΜ-5μΜ，例如，50ηΜ-1μΜ的FGF途徑抑制劑(例如，PD173074)。在一些實施方案中，本發明的培養物包括0.05-50 μ Μ，例如，0.1-5 μ Μ，例如，0.5 μ M的MEK抑制劑(例如，PD0325901)。在一些實施方案中，本發明的培養物包括0.05-20 μ Μ，例如，0.5-5 μ Μ，例如，
3μ M 的 GSK3 β 抑制劑(例如，CHIR99021)。
[0094] TGF^受體(例如，ALK5)抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向TGFβ受體(例如，ALK5)的反義核酸。示例性的TGF β受體/ALK5抑制劑包括，但不限于，SB431542 (參見，例如,Inman,等，Molecular Pharmacology (分子藥理學)62 (I):65-74(2002))，A-83-01，也已知為3-(6-甲基-2-吡啶基)-N_苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代酰胺(參見,例如，Tojo,等，Cancer Science (癌癥科學)96 (11):791-800(2005)，并且例如可從Toicris B1science (Toicris生物科學)商購獲得)；TGF- β RI激酶抑制劑II [2- (3- (6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑_4_基)-1，5- 二氮雜萘]；2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1Η-吡唑-4-基)-1，5_ 二氮雜萘，Wnt3a/B10(參見，例如，Dalton,等，W02008/094597,通過引用結合于此)，BMP4(參見，Dalton,同前所述)，GW788388 (- {4- [3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶 _2_ 基} N-(四氫-2H-吡喃-4-基)苯甲酸胺)(參見,例如,Gellibert,等,Journal of Medicinal Chemistry (醫學化學雜志)49 (7):2210-2221 (2006))，SM16 (參見，例如，Suzuki，等，Cancer Research (癌癥研究)67(5):2351-2359(2007)), IN-1130 (3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(參見，例如，Kim，等，Xenob1tica38(3):325-339 (2008))，GW6604 (2-苯基-4- (3-吡啶-2-基-1H-吡唑 _4_ 基)吡啶)(參見，例如，de Gouville,等，Drug News Perspective (藥物信息觀點)19 (2):85-90(2006)),SB-505124 (2-(5-苯[1，3]間二氧雜環戊烯_5_基-2-叔-丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶氫氯化物)(參見，例如，DaCosta,等,Molecular Pharmacology (分子藥理學)65(3):744-752(2004))和嘧啶衍生物(參見，例如，在Stiefl，等，W02008/006583中列出的那些，通過引用結合于此)。不意欲限制本發明的范圍，據信ALK5抑制劑影響間質向上皮的轉化/轉變(MET)過程。TGFii/激活蛋白途徑是上皮向間質轉變(EMT)的推動劑。因此，抑制TGF β /激活蛋白途徑可以促進MET (即，重編程)過程。
[0095]考慮本文中顯示抑制ALK5的作用的數據，據信TGF0 /激活蛋白途徑的抑制將具有相似的作用。因此，TGFii/激活蛋白途徑的任何抑制劑(例如，上游或下游)可以與本文每段中所述的ALK5抑制劑組合使用或替代ALK5抑制劑使用。示例性的TGF β /激活蛋白途徑抑制劑包括，但不限于:TGF β受體抑制劑，SMAD2/3磷酸化抑制劑，SMAD2/3和SMAD4相互作用抑制劑，以及SMAD6和SMAD7的激活劑/激動劑。此外，下文所述的分類僅是為了組織目的，并且本領域技術人員已知化合物可以影響途徑中的一點或多點，并且因此化合物可以在多于一種所定義的分類中起作用。
[0096]TGF^受體抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向TGFii受體的反義核酸。抑制劑的具體實例包括但不限于，SU5416 ;2-(5_苯[1，3]間二氧雜環戊烯-5-基-2-叔-丁基-3Η-咪唑基-4-基)-6-甲基吡啶氫氯化物(SB-505124);樂地單抗(Ierdelimumb) (CAT-152);美替木單抗(metelimumab) (CAT-192) ;GC_1008 ；ID11 ；AP-12009 ；AP-11014 ；LY550410 ；LY580276 ；LY364947 ；LY2109761 ；SB-505124 ；SB-431542 ；SD-208 ；SM16 ;NPC_30345 ；Ki26894 ；SB-203580 ;SD_093 ;格列衛(Gleevec) ;3，5，7，2 '，
4'-五輕黃酮(3, 5, 7, 2 ' , 4 ' -pentahydroxyf lavone)(桑色素(Morin));激活蛋白-M108A ；P144 ;可溶TBR2_Fc ;和靶向TGF β受體的反義轉染的腫瘤細胞。(參見，例如，Wrzesinski,等,Clinical Cancer Research (臨床癌癥研究)13 (18):5262-5270 (2007)；Kaminska,等，Acta B1chimica Polonica52(2):329-337(2005);和 Chang,等，Frontiersin B1science (生物科學前沿)12:4393-4401 (2007))。
[0097]SMAD2/3磷酸化的抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向SMAD2或SMAD3的反義核酸。抑制劑的具體實例包括PD169316 ；SB203580 ；SB-431542 ；LY364947 ;A77_01 ；和3,5,7,2' ,4 '-五輕黃酮(桑色素(Morin))。(參見，例如，Wrzesinski,同前所述；Kaminska,同前所述；Shimanuki,等，Oncogene (癌基因)26:3311-3320 (2007)；和Kataoka,等，EP1992360,通過引用結合于此。)
[0098]SMAD2/3和smad4相互作用的抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向SMAD2, SMAD3和/或smad4的反義核酸。SMAD2/3和SMAD4相互作用抑制劑的具體實例包括但不限于，Trx-SARA, Trx-xFoxHlb 和 Trx-Lefl.(參見，例如，Cui,等,Oncogene (癌基因)24:3864-3874(2005)和 Zhao，等，Molecular B1logy of the Cell(分子分子生物學)，17:3819-3831(2006))ο
[0099]MEK的抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶標MEK的反義核酸。MEK抑制劑的具體實例包括，但不限于，PD0325901,(參見，例如，Rinehart,等,Journal ofClinical Oncology (臨床腫瘤學雜志)22:4456-4462 (2004))，PD98059 (例如，可從 CellSignaling Technology (細胞信號傳導技術)獲得)，U0126 (例如，可從 Cell SignalingTechnology (細胞信號傳導技術)獲得)，SL327 (例如,可從Sigma-Aldrich (西格瑪-奧地里奇)獲得)，ARRY-162 (例如，可從Array B1pharma獲得)，PD184161 (參見，例如 Klein,等，Neoplasia(瘤形成)8:1-8 (2006))，PD184352 (C1-1040)(參見，例如，Mattingly,等，The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (藥理學和實驗治療學雜志)316:456-465 (2006))，舒尼替尼(sunitinib)(參見，例如，Voss，等，US2008004287，其通過引用并入本文)，索拉非尼(sorafenib)(參見，Voss同前所述)，凡德他尼(Vandetanib)(參見,Voss同前所述)，帕唑帕尼(pazopanib)(參見,例如,Voss同前所述)，阿昔替尼(Axitinib)(參見，Voss同前所述)和PTK787 (參見，Voss同前所述)。
[0100]目前，一些MEK抑制劑正在進行臨床實驗評估。C1-1040已經在I期和II期癌癥臨床實驗中進行評估(參見，例如，Rinehart,等，Journal of Clinical Oncology (臨床腫瘤學雜志)22(22) =4456-4462 (2004)) ο臨床實驗中評估的其它MEK抑制劑包括PD184352 (參見，例如，English,等，Trends in Pharmaceutical Sciences (制藥科學趨勢)23 (I):40-45(2002)), BAY43-9006 (參見，例如，Chow，等，Cytometry (血細胞計數)(Communicat1ns in Clinical Cytometry (臨床血細胞技術通訊))46:72-78 (2001)),PD-325901(也為 PD0325901)， GSK1120212, ARRY-438162， RDEAl19, AZD6244(也為ARRY-142886 或 ARRY-886)，R05126766，XL518 和 AZD8330 (也為 ARRY-704)。(參見，例如，來自全國衛生研究所(Nat1nal Institutes of Health)位于萬維網 www.clinicaltrials.gov的信息以及來自全國癌癥研究所(Nat1n Cancer Institute)位于萬維網www.cancer, gov/clinicaltrials 的信息。
[0101]p38(還已知為CSBP，mHOGl, RK和SAPK2)抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向P38的反義核酸。抑制劑的具體實例包括但不限于SB203580 (4- (4-氟苯基)-2- (4-甲基亞磺酰苯基)-5- (4-吡啶基)IH-咪唑)；SB202190 (4- (4-氟苯基)-2-(4-羥苯基)-5(4-吡啶基)-1Η-咪唑);SB220025 ；N-(3-叔-丁基-1-甲基-5-吡唑基)-N ' -(4-(4-吡啶基甲基)苯基)脲；RPR200765A ;UX_745 ;UX_702 ；UX-850 ；SC10-469 ；RWJ-67657(Rff Johnson Pharmaceutical Research Institute(RW約翰遜制藥研究所))；RDP-58 (SangStat Medical Corp.(SangStat 醫藥公司)；由Genzyme Corp.(Genzyme 公司)獲得)；Sc1s_323 (SC10323 ；Sc1s Inc.(Sc1s 公司))；Sc1s-469(SC10-469 ；Sc1s Inc.(Sc1s 公司));MKK3/MKK6 抑制劑(Signal ResearchDivis1n(信號研究部門));p38/MEK 調節劑(Signal Research Divis1n(信號研究部門))；SB-210313 類似物；SB-238039 ；HEP-689(SB235699) ；SB-239063 ；SB-239065 ；SB-242235 (SmithKline Beecham Pharmaceuticals (SmithKline Beecham 制藥))；VX_702和 VX-745(Vertex Pharmaceuticals Inc.(Vertex 制藥公司))；AMG_548(Amgen Inc.(Amgen 公司))；Astex p38 激酶抑制劑(Astex Technology Ltd.(Astex 技術有限公司))；RPR-200765 類似物(Aventis SA) ；Bayer p38 激酶抑制劑(Bayer Corp.(Bayer 公司))；BIRB-796 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.(Boehringer Ingelheim 制藥公司))；Celltech p38MAP 激酶抑制劑(Celltech Group pic.(Celltech 集團股票上市公司))；FR-167653 (Fujisawa Pharmaceutical C0.Ltd.(Fujisawa 制藥有限公司))；SB-681323 和 SB-281832 (GlaxoSmithKline pic (GlaxoSmithKline 股票上市公司))；LEO制藥MAP激酶抑制劑(LEO Pharma A/S) ；Merck C0.(默克公司)p38MAP激酶抑制劑(Merck research Laboratories (默克研究實驗室));SC_040 和 SC-XX906 (MonsantoC0.(Monsanto 公司))；腺苷 A3 拮抗劑(Novartis AG) ;p38MAP 激酶抑制劑(NovartisPharma AG) ；CN1-1493 (Picower Institute for Medical Research (Picower 醫藥研究所))；RPR-200765A(Rhone-Poulenc Rorer Ltd.(Rhone-Poulenc Rorer 有限公司))；和Roche p38MAP 激酶抑制劑(例如，R03201195 和 R04402257 ;Roche B1science (羅氏生物科學))。參見，例如，Roux,等，Microb1logy and Molecular B1logy Reviews(微生物和分子生物學綜述)68 (2):320-344 (2004) ;Engelnan,等，Journal of B1logicalChemistry (生物化學雜志)273(48):32111-32120(1998) ;Jackson,等，Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics (藥理學和實驗治療學雜志)284 (2):687-692 (1998) ;Kramer,等，Journal of B1logical Chemistry (生物化學雜志)271 (44):27723-27729(1996);和 Menko,等，US20080193504。
[0102]另外的p38抑制劑包括但不限于，1,5- 二芳基-取代的吡唑和取代的吡唑化合物(US6509361和US6335336);取代的吡啶基化合物(US20030139462);喹唑啉衍生物(US6541477，US6184226，US6509363 和 US6635644);芳基脲和雜芳基類似物(US6344476)；雜環脲(W01999/32110);其它脲化合物(W01999/32463，W01998/52558, W01999/00357 和W01999/58502);以及取代的咪唑化合物和取代的三唑化合物(US6560871和US6599910)。
[0103]Erk抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向Erk的反義核酸。Erk抑制劑的具體實例包括但不限于Η)98059(參見，例如，Zhu，等，Oncogene(癌基因)23:4984-4992(2004))，U0126(參見，Zhu,同前所述)，FR180204 (參見，例如，Ohori, DrugNews Perspective (藥物信息觀點)21(5):245-250 (2008))，舒尼替尼(參見，例如，Ma，等，US2008004287，其通過引用結合于此)，索拉非尼(參見，Ma，同前所述)，凡德他尼(參見，Ma,同前所述)，帕唑帕尼(參見，Ma,同前所述)，阿昔替尼(參見，Ma,同前所述)和PTK787 (參見，Ma,同前所述)。Erk抑制劑可以包括僅抑制Erk的分子或還抑制第二靶標的分子。例如，在一些實施方案中，所述Erk抑制劑是:
[0104]
【權利要求】
1.通過至少一次細胞分裂培養多能細胞的方法，所述方法包括: 在充足量的: a.MEK抑制劑； b.GSK3 β抑制劑；和 c.充分的營養足夠的時間， 存在時培養多能動物細胞，以允許至少一次細胞分裂同時保持細胞的多能性，其中所述多能動物細胞不是人胚胎干細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述GSK30抑制劑是CHIR99021。
3.權利要求1的方法，其中所述MEK抑制劑是Η)0325901。
4.權利要求1的方法，其中所述多能動物細胞進一步在充足量的TGF-β抑制劑存在時培養。
5.權利要求4的方法，其中所述TGF-β抑制劑是ALK5抑制劑。
6.權利要求5的方法，其中所述ALK5抑制劑是Α-83-01。
7.權利要求5的方法，其中所述ALK5抑制劑是SB431542。
8.權利要求1的方法，其中所述多能動物細胞進一步在存在足量成纖維細胞生長因子(FGF)受體抑制劑時培養。
9.權利要求8的方法，其中所述FGF受體抑制劑是ΗΗ73074。
10.權利要求1的方法，其還包括在充足量的bFGF存在時培養所述多能動物細胞。
11.權利要求1的方法，其中所述多能動物細胞通過至少5次細胞分裂進行培養，同時保持細胞多能性。
12.權利要求1的方法，其還包括向所述多能動物細胞中引入異源核酸，并且培養所得到的細胞，以允許至少一次另外的細胞分裂，同時保持多能性。
13.權利要求12的方法，其中將異源核酸引入到所述多能動物細胞中，然后誘導多能性，再然后進行培養步驟。
14.權利要求1的方法，其中所述多能動物細胞是大鼠細胞或人細胞。
15.權利要求1的方法，其中所述多能動物細胞是靈長類、羊、牛、貓、狗、或豬的細胞。
16.權利要求1的方法，其中所述多能動物細胞是胚胎干細胞。
17.權利要求1的方法，其中所述多能動物細胞是誘導的多能干細胞。
18.多能哺乳動物細胞的培養物，其包括充足量的: a.MEK抑制劑；和
b.GSK3 β抑制劑； 以允許至少一次細胞分裂，同時保持細胞多能性，其中所述多能動物細胞不是人胚胎干細胞。
19.權利要求18的培養物，其中所述GSK30抑制劑是CHIR99021。
20.權利要求18的培養物，其中所述MEK抑制劑是Η)0325901。
21.權利要求18的培養物，其還包括充足量的TGF-β抑制劑。
22.權利要求21的培養物，其中所述TGF-β抑制劑是ALK5抑制劑。
23.權利要求22的培養物，其中所述ALK5抑制劑是Α-83-01。
24.權利要求22的培養物，其中所述ALK5抑制劑是SB431542。
25.權利要求18的培養物，其還包括足量成纖維細胞生長因子(FGF)受體抑制劑。
26.權利要求25的培養物，其中所述FGF受體抑制劑是HH73074。
27.權利要求18的培養物，其還包括充足量的bFGF。
28.權利要求18的培養物，其中所述細胞是人細胞或大鼠細胞。
29.權利要求18的培養物，其中所述細胞是胚胎干細胞。
30.一種細胞培養基，其包括充足量的下述: a.MEK抑制劑；和 b.GSK3 β抑制劑； 從而在所述培養基中培養多能細胞時，允許至少一次細胞分裂，同時保持細胞多能性。
31.權利要求30的培養基，其中所述GSK30抑制劑是CHIR99021。
32.權利要求30的培養基，其中所述MEK抑制劑是Η)0325901。
33.權利要求30的培養基，其還包括充足量的TGF-β抑制劑。
34.權利要求33的培養基，其中所述TGF-β抑制劑是ALK5抑制劑。
35.權利要求34的培養基，其中所述ALK5抑制劑是Α-83-01。
36.權利要求34的培養基，其中所述ALK5抑制劑是SB431542。
37.權利要求30的培養基，其還包括足量成纖維細胞生長因子(FGF)受體抑制劑。
38.權利要求37的培養基，其中所述FGF受體抑制劑是ΗΗ73074。
39.權利要求30的培養基，其還包括充足量的bFGF。
40.權利要求30的培養基，其中所述培養基在預先包裝的、密封容器中。
41.通過權利要求1-17中任一項的方法獲得的分離的多能動物細胞，條件是所述分離的多能動物細胞不是胚胎干細胞(ESC)。
42.權利要求41的分離的細胞，其中所述分離的多能動物細胞是人細胞。
43.權利要求41的分離的細胞，其中所述分離的多能動物細胞是大鼠細胞。
【文檔編號】C12N5/0735GK104130976SQ201410347355
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2009年12月16日 優先權日:2008年12月17日
【發明者】李文林, 周宏彥, 丁生 申請人:斯克里普斯研究所