一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法
【專利摘要】本發明提供了一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟：A.清洗；B.高溫處理；C.發酵；D.除雜酶解；E.第一道大米蛋白的制備；F.第二道大米蛋白的制備；G.大米免疫肽的制備；H.低蛋白大米干燥；所述方法所得到的低蛋白大米，粒度完整，口感與普通大米接近，保證了大米免疫肽的高提取率和高純度，所制備的大米免疫肽具有增強免疫力等效果，為大米資源廣泛應用奠定了重要的基礎。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及大米產品制備領域，尤其是一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的 方法。 一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法

【背景技術】
[0002] 大米蛋白以其較高的生物利用率、合理的氨基酸組成、特有的低敏性等特點被認 為是優質蛋白質，在各種糧食中均居第一位，與牛乳、豆類蛋白相比更適合于飼料、嬰幼兒、 老年人及特殊人群。但由于大米內僅含有約8%的蛋白質，且胚乳細胞中的淀粉顆粒和蛋白 質結合緊密，造成提取成本高、難度大等問題，目前關于功能性大米產品的研究也不是很深 入。
[0003] 在一定條件下，蛋白經酶解可以得到多種生物活性肽，分別具有降低血壓、調節免 疫力、增強食品風味、抗氧化作用等功能。它們大多以非活性狀態存在于蛋白質長鏈中，一 旦經過酶解成為適當長度的肽，就可表現出調節機體免疫力的生理活性并保持低過敏性。 在已獲得的生物活性肽中，動物源活性肽占大多數而植物源活性肽逐漸成為研究的新亮 點，免疫活性肽是一類促進淋巴細胞分化和成熟，轉移免疫信息，抗腫瘤和抗菌作用的活性 肽。目前已有研究表明，從大米蛋白水解物中獲得的免疫活性肽具有促進平滑肌收縮、刺激 體外人血白細胞吞噬活性、刺激白細胞產生超氧陰離子的作用。
[0004] 目前，我國對于大米免疫肽的研究還處于初步階段，大部分研究方法是采用的將 大米粉碎、磨漿并通過蛋白酶酶解制備大米活性肽的方法，如CN102229643A公開了一種高 純度大米蛋白和高純度大米肽的制備方法，是以大大米或碎大米為原料，通過堿提酸沉方 法制備大米蛋白粗品基礎上，通過復合酶除雜制備高純度大米蛋白，再經復合蛋白酶作用 和交替式酶解超濾偶聯技術制備大米肽。CN103555795A公開了一種聯產高純度大米淀粉和 大米蛋白的方法，是以大米為原料，通過洗大米、浸泡磨漿、酶解及沉降分離等步驟處理后， 得到高純度的大米蛋白產品，再經堿性蛋白酶和乙醇純化、分離和干燥后得到高純度的大 米淀粉產品。在上述方法中，高純度大米蛋白和大大米肽的制備方法采用了酸堿提取大米 蛋白的方法，在食品生產中容易存在安全性問題，且方法會產生大米副產物資源的浪費；而 聯產高純度大米淀粉和大米蛋白的方法，雖然對大米淀粉和大米蛋白進行了提純，但提純 后的大米淀粉在加工應用上易受限制。加工制成的淀粉制品成本提高、口感與普通大米差 別大，很難滿足需要低蛋白飲食人群對大米風味的需求。此外，國內也有部分專利以大米渣 為原料制備大米活性肽，但由于大米渣成分復雜，提取難度較大，不易保證蛋白的提取率和 純度。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題在于提供一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的 方法。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0007] -種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0008] A.清洗：
[0009] 常溫下，將大米與水投入反應容器中，大米和水的重量比為1:2?5,攪拌1?5分 鐘，排掉清洗液，重復清洗（1?5次），排掉清洗液，浙干大米；
[0010] B.高溫處理：
[0011] 將大米加入到60?100°C的水溶液中攪拌1?10分鐘，然后倒出洗液，加水冷卻 清洗，浙干大米（重復1?6次，洗液可回收）；
[0012] C.發酵：
[0013] 將大米、水、乳酸菌和乳酸添加到發酵容器中，其中大米和水的重量比為1:1? 6,控制每公斤發酵液中乳酸菌菌數為10 7?1013,乳酸添加量為每公斤發酵液中加50%? 80%乳酸50?500 μ L，發酵溫度為25?50°C，時間為8?20小時，發酵終點為發酵液pH 為3. 5?4. 5 ;發酵結束后將大米和發酵液分尚，大米用水清洗1?6次，將清洗液與發酵 液一并回收，采用135?150°C，滅菌4?6秒，即為發酵產酸溶出的蛋白溶液；
[0014] D.除雜酶解：
[0015] 向反應容器中加入水，控制大米和水的質量比例為1:1?6,采用淀粉酶、纖維素 酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入量為大米重量〇. 05?0. 30%，反應溫度為50? 65°C，反應pH控制為5. 5?7.0,時間為10?60分鐘；纖維素酶投入量為大米重量的 0. 05?0. 30%，反應溫度為35?50°C，pH控制為4. 0?6. 0,時間為1?4小時；脂肪酶 投入量為大米重量的〇. 05?0. 20%，反應溫度為40?55°C，pH控制為6. 5?8. 0,時間為 1?4小時；酶解結束后，將酶解液放出，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液一并回收；
[0016] E.第一道大米蛋白的制備：
[0017] 將步驟C、D反應液及洗液合并，調節pH至5. 0?5. 5,用離心機2000?5000rpm 離心10?30分鐘，獲得沉淀；向沉淀中加入水和0. 02?0. 10%淀粉酶，于50?65°C酶解 10?30分鐘，經相同離心方式離心，沉淀即為大米蛋白第一道產物；
[0018] F.第二道大米蛋白的制備：
[0019] 將步驟D處理后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:1?6,投入谷氨酰胺酶， 投入量為大米重量的〇. 05?0. 30%，反應溫度為30?65°C，反應pH控制為5. 0?7. 0,酶 解時間為1?3小時；投入蛋白酶，其中蛋白酶投入量為大米重量的0. 2?4. 0%，反應溫度 為30?60°C，反應pH控制為3. 5?8. 0,酶解時間為1?8小時；反應結束后分離反應液， 用水清洗大米兩次，將洗液與反應液一并回收，獲得的大米即為低蛋白大米；然后將洗液與 反應液用離心機2000?5000rpm離心10?30分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0020] G.大米免疫肽的制備：
[0021] 將步驟E得到的產物，與水混合，沉淀與水的質量比例為1:1?6,用蛋白酶進行酶 解，蛋白酶投入量為水重的〇. 2?4. 0%，反應溫度為30?60°C，pH控制為3. 5?8. 0,時 間為1?6小時；酶解結束后，將反應溶液用離心機2000?5000rpm離心10?30分鐘，取 上清液后與步驟F得到的上清液混合，于90°C滅酶5?20min;將滅酶后的上清液經超濾膜 系統和納濾膜分別進行濃縮后，對濃縮液進行噴霧干燥，得到固體粉末即為所述的大米免 疫肽；
[0022] H.低蛋白大米干燥：
[0023] 將得到的低蛋白大米用水清洗干凈后，進行干燥。
[0024] 上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所得干燥后低蛋白大米取部分烘 干至干基狀態，粉碎用于檢測干基中蛋白含量。
[0025] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為乳桿菌屬。
[0026] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為植物乳桿 菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿菌中的任意一種或兩 種。
[0027] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為植物乳桿 菌時，可提供好氧條件，即1公斤大米和發酵液的混合物的無菌空氣通入量為〇. 5?2L/ min〇
[0028] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為植物乳桿 菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿菌在兩種組合使用時， 二者菌數控制在1?2:2?1之間。
[0029] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述大米原料可以替換 為薏米、高粱米、黑米、大麥或燕麥。
[0030] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述淀粉酶、纖維素酶和 脂肪酶的添加順序是依次加入到料液中，當一種酶作用結束后再投入另一種，并保證每種 酶在其適宜的溫度和pH下酶解。
[0031] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步驟E得到的沉淀 可與水混合，然后重復步驟E方法2?3次，取最終沉淀。
[0032] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述蛋白酶為來自動物 的胰蛋白酶、胃蛋白酶，來自植物的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，以及來自微生物發酵的酸性 蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶中的任意兩種或三種；當采用兩種混合酶時， 其中二者質量比例控制在1?5:5?1之間，當采用三種混合酶時，其中三者質量比例控制 在1?5:5?1:5?1之間，且分步加入，反應從始至終保證每種蛋白酶作用的pH及溫度。
[0033] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步驟G中超濾膜其 截留分子量為3000?6000Da，納濾膜其截留分子量為200?600Da ;采用的噴霧干燥方法， 噴霧干燥控制進風溫度為160?210°C，出口溫度為60?90°C。
[0034] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步驟Η得到的低蛋 白大米干燥的方式為在60?105°C條件下烘干，所述烘干方式為恒溫干燥、真空干燥、蒸汽 烘干或微波干燥的任意一種或任意兩種，控制產品水分含量在14%以內。
[0035] 優選的，上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，為了證明大米免疫肽可 顯著地提高機體的免疫能力，用所獲得的大米免疫肽粉對昆明種小鼠進行灌胃實驗，檢測 小鼠抗體生成細胞含量（PFC);同時，利用體外實驗檢測大米免疫肽對腹腔巨噬細胞吞噬 能力的影響。具體方法為：將腹腔注射綿羊紅細胞（SRBC)的大米免疫肽灌胃小鼠進行眼 球取血處死，調整脾細胞濃度與10%豚鼠血清補體和0. 2% SRBC混合，37°C水浴1小時，離 心，上清在413nm處的吸光值表示抗體生成細胞含量；取正常小鼠腹腔巨噬細胞，于細胞板 中37°C培養至貼壁生長，離心去上清，加入大米免疫肽刺激培養24小時，離心去上清，加入 FITC標記的熱滅活大腸桿菌液，培養1小時，終止吞噬后，低溫離心，沉淀用PBS洗滌混勻， 在485nm激發光和530nm發射光下測定吞噬及表面熒光總和，經后續處理測定表面熒光值， 分析巨噬細胞吞噬能力。
[0036] 本發明的有益效果是：
[0037] 上述同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法所得到的低蛋白大米，粒度完整， 口感與普通大米接近，可適用于腎病和PKU患者的低蛋白飲食，緩解病情；也可用于釀酒、 大米加工食品等；所制備的高提取率和高純度的大米免疫肽，適用于老年人、嬰幼兒以及免 疫力低下人群食用，應用于乳豬、犢牛、水產養殖等畜牧業飼料中具有增強免疫力、增加食 量和提高生長速度等效果；本發明所述制備方法為大米資源廣泛應用于功能性食品、醫用 食品、畜牧產業的發展奠定了重要的基礎，可增加大米的整體經濟效益和功能性效益。

【具體實施方式】
[0038] 下面結合具體實施例對本發明所述技術方案作進一步的說明。
[0039] 實施例1
[0040] 一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0041] A.普通大米，投入反應容器中，加入約3倍重量的水，攪拌1分鐘，倒掉清洗液，重 復3次；
[0042] B.將大米用80°C水攪拌處理5min，去除浸泡水，加水冷卻2次，將每次倒出的洗液 進行回收備用；
[0043] C.將大米、水、植物乳桿菌添加到發酵容器中，大米和水的質量比為1:2,控制每 公斤發酵液中植物乳桿菌數為8X 10^80%乳酸添加100 μ L，發酵溫度為37°C，發酵時間 16小時，發酵過程通入無菌空氣，1公斤大米和發酵液的混合物通氣量為1. 2L/min ;發酵結 束后分離大米和發酵液，清洗大米3次，將發酵液與洗液于135°C滅菌4秒；
[0044] D.大米與3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉 酶投入大米量的〇. 10%，反應溫度為55°C，pH控制為6.0,酶解40分鐘；纖維素酶投入大米 量的0. 05%，于40°C，pH4. 5,酶解1. 5小時；脂肪酶投入大米量的0. 10%，于45°C，pH6. 5， 酶解1. 5小時；酶解結束后，將酶解液取出，用水清洗大米兩次，洗液與酶解液一并回收；
[0045] E.將步驟B、C、D反應液及洗液合并，調節pH至5. 0,用離心機4000rpm低溫離心 15分鐘，獲得沉淀，向沉淀中加入水和0. 05 %淀粉酶，于55 °C酶解20分鐘，再經相同條件離 心，沉淀即為第一道大米蛋白產物；
[0046] F.將步驟D處理后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:2,投入大米重量 0. 10%的谷氨酰胺酶，于45°C，pH7. 0,酶解2小時；投入質量為大米重量的0. 4%胰蛋白酶， 反應溫度為45°C，pH8. 0,酶解2小時；再加入0. 8%菠蘿蛋白酶，反應溫度為45°C，pH6. 5， 酶解4小時；再加入0. 2%酸性蛋白酶，反應溫度為45°C，pH3. 5,酶解2小時，分離酶解液， 用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的大米即為低蛋白大米；然后將洗液與酶解 液用離心機4000rpm離心15分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0047] G.將步驟E得到的產物與水混合，沉淀與水的質量比例為1:3,用0. 3 %胰蛋白 酶和0. 6 %菠蘿蛋白酶進行酶解，反應條件與上步蛋白酶解相同；結束后，酶解液用離心 機4000rpm離心15分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶15min ;上清液經 3000Da超濾膜系統和200Da納濾膜分別進行濃縮后，對濃縮液進行噴霧干燥，控制進風溫 度為180°C，出風溫度為80°C，即得固體粉末即為大米免疫肽，經實驗大米免疫肽提取率為 85. 9%，純度為 90. 1% ;
[0048] H.對低蛋白大米用水清洗后于微波烘干，至大米水含量低于13%，經凱氏定氮法 測定，大米中蛋白去除率為95 %。經免疫活性評價實驗證明，大米免疫肽灌胃的受試小鼠組 與對照組相比，抗體生成細胞含量（PFC)提高15% (P〈0. 05);經體外實驗結果顯示，大米免 疫肽可使腹腔巨噬細胞吞噬能力提高10% (P〈〇. 05)，表明大米免疫肽可顯著地提高機體 的免疫能力。
[0049] 實施例2
[0050] -種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0051] A.黑米投入反應容器中，加入約2倍重量的水，攪拌3分鐘，倒掉清洗液，重復3 次；
[0052] B.將黑米用70°C水攪拌處理4min，去除浸泡水，加水冷卻清洗3次，浙干黑米；
[0053] C.將黑米、水、德式乳桿菌和保加利亞乳桿菌添加到發酵容器中，黑米和水的質量 比為1:3,控制每公斤發酵液中德式乳桿菌和保加利亞乳桿菌菌數各為1X 109,80%乳酸添 加150 μ L，發酵溫度為37°C，發酵時間12小時，發酵結束后分離黑米和發酵液，清洗黑米3 次，將清洗液與發酵液一并收回，將發酵液與洗液于140°C滅菌5秒，即為發酵產酸溶出的 蛋白溶液；
[0054] D.黑米與3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶水解黑米，其中淀粉 酶投入黑米量的0. 10%，反應溫度為60°C，pH控制為6. 0,酶解30分鐘；纖維素酶投入黑米 量的0. 07%，于42°C，pH4. 5,酶解1. 5小時；脂肪酶投入黑米量的0. 05%，于45°C，pH7. 0， 酶解1. 5小時；酶解結束后，將酶解液取出，用水清洗黑米兩次，洗液與酶解液一并回收；
[0055] E.將步驟C、D反應液及洗液合并，調節pH至5. 0,用離心機4000rpm離心20分 鐘，獲得沉淀，向沉淀中加入水和〇. 05%淀粉酶，于55°C酶解20分鐘，再經相同條件離心， 沉淀即為黑米蛋白第一道產物；
[0056] F.將酶解后的黑米與水混合，黑米與水的重量比為1:3,投入米量0.05%的谷氨 酰胺酶，于45°C，pH6. 0,酶解2小時；投入質量為黑米重量的0. 5 %酸性蛋白酶，反應溫度 為45°C，pH3. 5,酶解3小時；再加入1. 0%堿性蛋白酶，反應溫度為42°C，pH8. 0,酶解3小 時，分離酶解液，用水清洗黑米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的黑米即為低蛋白黑米；然 后將洗液與酶解液用離心機4000rpm離心20分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0057] G.將步驟E得到的產物與水混合，沉淀與水的質量比例為1:3,用0. 3 %的酸性 蛋白酶和〇. 4%的堿性蛋白酶酶解，反應條件與上步蛋白酶解相同；結束后，酶解液用離心 機4000rpm離心20分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶15min ;上清液經 5000Da超濾膜系統和300Da納濾膜系統分別進行濃縮后，對濃縮液進行噴霧干燥，控制進 風溫度為200°C，出風溫度為70°C，即得固體粉末即為免疫肽。經凱氏定氮法測定黑米免疫 肽提取率為78%，純度為88. 7% ;
[0058] H.對低蛋白黑米用水清洗后于70°C真空干燥，至黑米水含量低于12%，經凱氏定 氮法測定，黑米中蛋白去除率為89. 6%。經免疫活性評價實驗證明，黑米免疫肽灌胃的受 試小鼠組與對照組相比，抗體生成細胞含量（PFC)提高14% (P〈0. 05);經體外實驗結果顯 示，黑米免疫肽可使腹腔巨噬細胞吞噬能力提高10% (P〈〇. 05)，表明黑米免疫肽可有效地 提1?機體的免疫能力。
[0059] 實施例3
[0060] -種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0061] A.普通大米，投入反應容器中，加入約2倍重量的水，攪拌1分鐘，倒掉清洗液，重 復3次；
[0062] B.將大米用60°C水攪拌處理5min，去除浸泡水，加水冷卻2次；
[0063] C.將大米、水、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌添加到發酵容器中，大米和水的質量 比為1:2,控制每公斤發酵液中嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌菌數各為1X 109,80%乳酸添 加100 μ L，發酵溫度為40°C，發酵時間10小時。發酵結束后分離大米和發酵液，清洗大米 2次，將發酵液與洗液于150°C滅菌4秒；
[0064] D.大大米與3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶水解大米，其中淀 粉酶投入大米量的〇. 05%，反應溫度為55 °C，pH控制為6. 0,酶解30分鐘；纖維素酶投入大 米量的0. 05%，于40°C，pH4. 5,酶解1小時；脂肪酶投入大米量的0. 05%，于45°C，pH6. 5， 酶解1小時。酶解結束后，將酶解液取出，用水清洗大米兩次，洗液與酶解液回收；
[0065] E.將步驟C、D反應液及洗液合并，調節pH至5. 0,用離心機5000rpm低溫離心10 分鐘，獲得沉淀，向沉淀中加入水和〇. 02%淀粉酶，于55°C酶解20分鐘，再經相同條件離 心，沉淀即為第一道大米蛋白產物。
[0066] F.將酶解后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:3,投入大米重量0.05%的 谷氨酰胺酶，于45°C，pH7. 0,酶解1小時；投入質量為大米重量的0. 4%酸性蛋白酶，反應溫 度為451：，？!13.5，酶解2小時；再加入0.8(%堿性蛋白酶，反應溫度為421：，？!18.0，酶解4 小時，分離酶解液，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的大米即為低蛋白大米。 然后將洗液與酶解液用離心機5000rpm離心10分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0067] G.將步驟E得到的產物與水混合，沉淀與水的質量比例為1:3,用0. 2 %酸性蛋 白酶和0. 4%堿性蛋白酶酶解，反應條件與上步蛋白酶解相同。結束后，酶解液用離心機 5000rpm離心10分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶lOmin。上清液經 5000Da超濾膜系統和300Da納濾膜系統分別進行濃縮后，對濃縮液進行噴霧干燥，控制進 風溫度為180°C，出風溫度為80°C，即得固體粉末即為大米免疫肽，經凱氏定氮法測定大米 免疫肽提取率為74%，純度為87. 3% ;
[0068] H.對低蛋白大米用水清洗后于70°C真空干燥，至大米水含量低于14%，經凱氏定 氮法測定，大米中蛋白去除率為82. 5%。經免疫活性評價實驗證明，大米免疫肽灌胃的受 試小鼠組與對照組相比，抗體生成細胞含量（PFC)提高10% (P〈0. 05);經體外實驗結果顯 示，大米免疫肽可使腹腔巨噬細胞吞噬能力提高10. 5% (P〈0. 05)，表明大米免疫肽可有效 地提高機體的免疫能力。
[0069] 實施例4
[0070] -種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0071] A.普通大米，投入反應容器中，加入約2倍重量的水，攪拌4分鐘，倒掉清洗液，重 復3次；
[0072] B.將大米用80°C水攪拌處理3min，去除浸泡水，加水冷卻2次；
[0073] C.將大米、水、短乳桿菌和干酪乳桿菌添加到發酵容器中，大米和水的質量比為 1:2,控制每公斤發酵液中短乳桿菌和干酪乳桿菌菌數各為2 X 109, 80%乳酸添加100 μ L， 發酵溫度為37°C，發酵時間14小時；發酵結束后分離大米和發酵液，清洗大米3次，將發酵 液與洗液于135°C滅菌4秒。淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶的條件及步驟（C、D、E)同實施例 3 ；
[0074] F.將酶解后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:3,投入大米重量0.04%的 谷氨酰胺酶，于45°C，pH7. 0,酶解1小時；投入質量為大米重量的0. 6%木瓜蛋白酶，反應溫 度為50°C，pH7. 0,酶解3小時；再加入1. 0%堿性蛋白酶，反應溫度為45°C，pH8. 0,酶解5 小時，分離酶解液，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的大米即為低蛋白大米。 然后將洗液與酶解液用離心機，5000rpm離心10分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0075] G.將步驟E得到的產物與水混合，沉淀與水的質量比例為1:2,用0. 2%木瓜蛋白 酶和0. 5%堿性蛋白酶進行酶解，反應條件與上步蛋白酶解相同。結束后，酶解液用離心機 5000rpm離心10分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶15min。上清液經 3000Da超濾膜系統和300Da納濾膜系統分別進行濃縮后，對濃縮液進行噴霧干燥，控制進 風溫度為200°C，出風溫度為90°C，即得固體粉末即為大米免疫肽，經實驗測定大米免疫肽 提取率為80 %，純度為88% ;
[0076] H.對低蛋白大米用水清洗后用微波干燥，至大米水含量低于14%，經凱氏定氮法 測定，大米中蛋白去除率為88. 9%。經免疫活性評價實驗證明，大米免疫肽灌胃的受試小鼠 組與對照組相比，抗體生成細胞含量（PFC)提高13% (P〈0. 05);經體外實驗結果顯示，大米 免疫肽可使腹腔巨噬細胞吞噬能力提高11.5% (P〈0. 05)，表明大米免疫肽可有效地提高 機體的免疫能力。
[0077] 工藝分析：
[0078] 上述一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，首先，采用高溫處理結合乳 酸菌發酵，去除雜菌并穩定大米粒型；同時發酵產生的乳酸具有α -羥基結構的羧酸，能與 多肽鏈上的基團形成氫鍵，從而促進蛋白質的溶出；其次，利用多步聯合酶解，通透大米胚 乳細胞結構，將與淀粉、纖維素和脂肪緊密結合的蛋白質釋放到料液中并除去這三種雜質； 利用谷氨酰胺酶和蛋白酶分別對大米粒中的蛋白質進行改性（增加溶解度）和切割，充分 提取大米蛋白并水解成多肽。整個工藝促進了大米整蛋白的析出和分離，保證了大米蛋白 酶解的穩定性，利于肽的提取和純化。
[0079] 該工藝與傳統方法相比，利用了乳酸菌發酵和多步酶解，條件溫和、安全，免去了 堿溶酸沉帶來的營養流失、雜質干擾以及安全問題，該方法制備的大米免疫肽提取率高，達 85%以上，純度達90%以上，經實驗，受試小鼠組的抗體生成細胞含量（PFC)和腹腔巨噬細 胞吞噬能力各提高了 15%和10% (Ρ〈0. 05)，證明大米免疫肽可顯著地提高機體的免疫能 力。在寵物飼料、乳仔豬料、高檔水產料、犢牛代奶粉中添加可代替動物蛋白制品，有利于提 高幼崽對營養的吸收、增強免疫力、增加食量和提高生長速度等效果，對飼用植物蛋白的產 業化具有巨大的市場利用價值。此外，還獲得了蛋白去除率達95%的低蛋白大米，實驗結果 表明該大米能保持良好的完整性，烘干后不易碎，蒸制后在口感和風味上與普通大米接近， 適用于慢性腎病患者和PKU患者。
[0080] 上述參照實施例對該一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法進行的詳細 描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離
【權利要求】
1. 一種同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：具體步驟如下： A. 清洗： 常溫下，將大米與水投入反應容器中，大米和水的重量比為1:2?5,攪拌1?5分鐘， 排掉清洗液，重復清洗1?5次，排掉清洗液，浙干大米； B. 高溫處理： 將大米加入到60?100°C的水溶液中攪拌1?10分鐘，然后倒出洗液，加水冷卻清洗， 浙干大米，重復1?6次，洗液可回收； C. 發酵： 將大米、水、乳酸菌和乳酸添加到發酵容器中，其中大米和水的重量比為1:1?6,控制 每公斤發酵液中乳酸菌菌數為1〇7?1〇13,乳酸添加量為每公斤發酵液中加50%?80%乳 酸50?500 μ L，發酵溫度為25?50°C，時間為8?20小時，發酵終點為發酵液pH為3. 5? 4. 5 ;發酵結束后將大米和發酵液分尚，大米用水清洗1?6次，將清洗液與發酵液一并回 收，采用135?150°C，滅菌4?6秒，即為發酵產酸溶出的蛋白溶液； D. 除雜酶解： 向反應容器中加入水，控制大米和水的質量比例為1:1?6,采用淀粉酶、纖維素酶和 脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入量為大米重量〇. 05?0. 30%，反應溫度為50?65°C， 反應pH控制為5. 5?7. 0,時間為10?60分鐘；纖維素酶投入量為大米重量的0. 05? 0. 30%，反應溫度為35?50°C，pH控制為4. 0?6. 0,時間為1?4小時；脂肪酶投入量為 大米重量的0. 05?0. 20%，反應溫度為40?55°C，pH控制為6. 5?8. 0,時間為1?4小 時；酶解結束后，將酶解液放出，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液一并回收； E. 第一道大米蛋白的制備： 將步驟C、D反應液及洗液合并，調節pH至5. 0?5. 5,用離心機2000?5000rpm離心 10?30分鐘，獲得沉淀；向沉淀中加入水和0. 02?0. 10 %淀粉酶，于50?65°C酶解10? 30分鐘，經相同離心方式離心，沉淀即為第一道大米蛋白產物； F. 第二道大米蛋白的制備： 將步驟D處理后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:1?6,投入谷氨酰胺酶，投入 量為大米重量的〇. 05?0. 30%，反應溫度為30?65°C，反應pH控制為5. 0?7. 0,酶解時 間為1?3小時；投入蛋白酶，其中蛋白酶投入量為大米重量的0. 2?4. 0%，反應溫度為 30?60°C，反應pH控制為3. 5?8.0,酶解時間為1?8小時；反應結束后分離反應液，用 水清洗大米兩次，將洗液與反應液一并回收，獲得的大米即為低蛋白大米；然后將洗液與反 應液用離心機2000?5000rpm離心10?30分鐘，取上清液，棄除沉淀； G. 大米免疫肽的制備： 將步驟E得到的產物與水混合，沉淀與水的質量比例為1:1?6,用蛋白酶進行酶解， 蛋白酶投入量為水重的〇. 2?4. 0%，反應溫度為30?60°C，pH控制為3. 5?8. 0,時間為 1?6小時；酶解結束后，將反應溶液用離心機2000?5000rpm離心10?30分鐘，取上清 液后與步驟F得到的上清液混合，于90°C滅酶5?20min ;將滅酶后的上清液經超濾膜系 統和納濾膜分別進行濃縮后，對濃縮液進行噴霧干燥，得到固體粉末即為所述的大米免疫 肽； H. 低蛋白大米干燥： 將得到的低蛋白大米用水清洗干凈后，進行干燥。
2. 根據權利要求1所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述乳酸菌為乳桿菌屬。
3. 根據權利要求2所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述乳酸菌為植物乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿 菌中的任意一種或兩種。
4. 根據權利要求3所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述乳酸菌為植物乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿 菌在兩種組合使用時，二者菌數控制在1?2:2?1之間。
5. 根據權利要求1所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述原料大米可以替換為薏米、高粱米、黑米、大麥或燕麥。
6. 根據權利要求1所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶的添加順序是依次加入到料液中，當一種酶作用結束后再投 入另一種，并保證每種酶在其適宜的溫度和pH下酶解。
7. 根據權利要求1所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述步驟E得到的沉淀可與水混合，然后重復步驟E方法2?3次，取最終沉淀。
8. 根據權利要求1所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述蛋白酶為胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性 蛋白酶、復合蛋白酶中的任意兩種或三種；當采用兩種混合酶時，其中二者質量比例控制在 1?5:5?1之間，當采用三種混合酶時，其中三者質量比例控制在1?5:5?1:5?1之 間，且分步加入，反應從始至終保證每種蛋白酶作用的pH及溫度。
9. 根據權利要求1所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述步驟G中超濾膜其截留分子量為3000?6000Da，納濾膜其截留分子量為200?600Da ; 采用的噴霧干燥方法，噴霧干燥控制進風溫度為160?210°C，出口溫度為60?90°C。
10. 根據權利要求1所述的同時制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述步驟Η得到的低蛋白大米干燥的方式為在60?105°C條件下烘干，所述烘干方式為恒溫 干燥、真空干燥、蒸汽烘干或微波干燥的任意一種或任意兩種，控制產品水分含量在14%以 內。
【文檔編號】A23L1/10GK104082673SQ201410352958
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】吳樂斌, 劉漢民, 常繼辰, 劉紅彥 申請人:中恩（天津）營養科技有限公司