一種茶樹低溫誘導型啟動子的制作方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，提供一種來源于茶樹的誘導型啟動子CsPE1α及其表達。本發明提供的誘導型啟動子為如下1)-2)中任一種DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有啟動子功能的DNA分子。本發明提供的啟動子可驅動目的基因在植物中表達，有助于人們對茶樹生長發育的研究，且為植物特別是山茶科的遺傳改造提供幫助，本發明提供的啟動子在低溫脅迫下誘導啟動抗寒基因來有效防治凍害。同時，茶樹耐寒性提高，適應氣候的能力提升，就能夠使緯度更高的地方生產茶葉。
【專利說明】一種茶樹低溫誘導型啟動子 一、

【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及一種低溫誘導型啟動子，包括含有該啟動子的結 構和載體，以及含有該啟動子或者所述結構或者載體的宿主細胞、轉基因植物。 二、 技術背景
[0002] 在細胞代謝過程中，丙酮酸脫氫酶系（pyruvate dehydrogenase complex, FOC)占 據關鍵的代謝位置，對能量代謝的影響意義重大。而roC-ΕΙα基因是連接能量代謝途徑的 閘門，該基因如果出現異常勢必影響整個能量代謝途徑。
[0003] 植物基因工程中常用的啟動子按其作用方式及功能可分為三類：組成型啟動子 (constitutive promoter)、組織特異型啟動子（tissue-specific promoter)和誘導型啟動 子（inducible promoter)。本發明所提供的啟動子CsPEla屬于誘導型啟動子。誘導型啟 動子一直以來都是植物基因工程研究的重點和難點。低溫作為最常見的逆境脅迫之一，對 植物尤其是茶樹的生長發育影響深遠，但對其相關啟動子的鑒定分離表達研究少之又少。 因此，對茶樹低溫誘導型啟動子的克隆與研究具有十分重要的意義。 三、


【發明內容】

[0004] 1、技術問題
[0005] 本發明目的是提供一種低溫誘導型啟動子，為植物生長發育和生理代謝的研究提 供基礎，尤其是在茶樹的遺傳育種中提供一條快速、經濟、有效的途徑。
[0006] 2、技術方案
[0007] 本發明的發明人首先采集中山陵茶場茶樹花粉，使用改良的CTAB法提取DNA。 然后根據本課題組克隆得到的茶樹花粉CsEla基因的cDNA序列（GenBank登錄號 ： JQ999982)設計引物，使用TAIL-PCR方法擴增其啟動子。驗證之后，引入酶切位點，構建瞬 時表達載體（PBI121-CSPE1 a -GFP)。基因槍轟擊法對低溫誘導性啟動子CsPEl α進行瞬時 表達分析。
[0008] 3、有益效果
[0009] 本發明針對上述現有技術的情況，首次提供了一個茶樹低溫誘導型啟動子。該啟 動子能夠有效響應低溫脅迫，調節下游基因表達量。對茶樹低溫誘導性啟動子的研究有助 于認識Ε?α基因的功能及丙酮酸脫氫酶系在茶樹中的作用機理。可以利用本發明啟動子 構建成各種植物表達載體，用于通過植物基因工程技術改善植物品質和其他有益生產性 狀。
[0010] 本發明所提供的低溫誘導型啟動子，可接受低溫刺激而使下游基因高效表達，克 服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物中非特異性的持續、高效表達所造成的浪 費，并且滿足某些需要外源基因特異表達的需求。將該啟動子應用于轉基因植物中，可以提 高轉基因植物的耐寒性，更好的抵御寒害、凍害，擴大種植范圍。本發明在農業領域具有廣 闊的應用空間和市場前景。 toon] 本發明提供的低溫誘導型啟動子來源于茶樹，有助于茶樹生長發育的研究。眾所 周知，明前茶品質優良，市場前景廣闊。提高茶樹抗寒能力可以提前茶樹發芽時間，延長明 前茶采摘時間，提高產量。同時，茶樹耐寒性提高，適應氣候的能力提升，就能夠使緯度更高 的地方生產茶葉，進而能夠擴大茶葉的生產區域，提高茶葉產量。另外，控制好茶樹的能量 代謝，就能夠更好的調節茶樹生長周期。通過合理灌溉，適時增肥，可以提高鮮葉品質，從而 獲得顯著的經濟效益。
[0012] 茶葉是最重要的經濟作物之一，寒害、凍害等低溫脅迫會造成茶葉產量減少以及 品質下降。茶樹抗寒基因的克隆以及啟動子的分離可以使我們更好地了解植物體響應低溫 脅迫的機理，并為基因工程改良奠定基礎。 四、

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1從茶樹花粉基因組DNA中TAIL-PCR擴增CsEl α的啟動子的電泳圖譜。
[0014] 其中，Μ泳道為DL2000Marker，從上到下片段依次為2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp ;箭頭處即為切膠回收的目的基因。
[0015] 圖2啟動子CsPEl α中預測到的順式表達元件，除了基本轉錄元件：CAAT_框 和TATA-框等外，該啟動子含有2個GATA-框，1個LTR，1個G-框，1個ARR1AT，1個 TGA-element等順式元件。
[0016] 圖3重組載體pBI121-CsPEl a -GFP的PCR鑒定圖譜。
[0017] 其中，Μ泳道為DL2000Marker，從上到下片段依次為2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp，泳道2為PCR所得產物的結果。
[0018] 圖4熒光體式顯微鏡下經基因槍轟擊轉入重組載體pBI121-CsPEl a -GFP的洋蔥 內表皮細胞的GFP熒光表達結果。
[0019] 圖5激光共聚焦顯微鏡下經基因槍轟擊轉入重組載體pBI121-CSPEl a -GFP的洋 蔥內表皮細胞的GFP熒光表達結果。 五、

【具體實施方式】
[0020] 下述實施例中所用方法若無特殊說明均為本領域慣用的技術手段，所用的試劑、 材料，如無特殊說明均可通過商業途徑得到。
[0021] 下面結合附圖對本發明的方法進行詳細的描述，但是以下描述的目的是示例性 的，而不是限制本發明的范圍。
[0022] 實施例1、植物逆境脅迫誘導表達型啟動子CsPEla的獲得
[0023] 1.引物設計
[0024] 根據茶樹花粉CsEl a基因的cDNA序列，設計引物擴增其啟動子，具體引物序列如 下：
[0025] 特異性引物序列：
[0026] GSP1 :如 SEQ ID N0. 2 所示；
[0027] GSP2 :如 SEQ ID NO. 3 所示；
[0028] GSP3 :如 SEQ ID NO. 4 所示；
[0029] 隨機引物：
[0030] ADI :如 SEQ ID NO. 5 所不：5' -tgwgnagwan casaga-3'，其中，w = a 或 t ;n = a或g或c或t;s = g或c;
[0031] AD2 :如 SEQ ID NO. 6 所不：5' -cawcgicnga iasgaa-3'，其中，w = a 或 t ;i = a或g或c或t;n = a或g或c或t;s = g或c;
[0032] AD3 :如 SEQ ID NO. 7 所示：5' -ntcgastwts gwgtt-3'，其中，n = a 或 g 或 c 或 t ；s = g c ；w = a t ；
[0033] AD4 :如 SEQ ID NO. 8 所示：5' -ntcgastwts gwgtt-3'，其中，n = a 或 g 或 c 或 t ；s = g c ；w = a t ；
[0034] AD5 :如 SEQ ID NO. 9 所不：5 ' -gtcgaswgan awgaa-3 '，其中，s = g 或 c;w = a 或t;n = a或g或c或t;
[0035] AD6 :如 SEQ ID NO. 10 所不：5' -wgtgnagwan canaga-3'，其中，w = a 或 t ;n = a或g或c或t ; 〇
[0036] 2. TAIL-PCR 擴增
[0037] 以茶樹花粉基因組DNA為模板，以AD和GSP1為引物進行PCR擴增反應， 反應體系為：模板 DNA 1 μ L，dNTP Mixture (每種 2. 5mm) 8 μ L，10 X LA PCR Buffer II (Mg2+plus)5 μ L, TaKaRa LA Taq (5U/μ 1) 0. 5 μ L, AD Primer (lOOpmol/μ 1) 1 μ L, GSP1 (lOpmol/ μ 1)，ddH20 33. 5 μ L，總體積 50 μ L。反應程序為：94 °C 變性 lmin， 再 98 °C lmin ;緊接著 5 個循環為 94 °C 30s，68 °C lmin，72 °C 2min ;接著 94 °C 30s， 25°C 3min，72°C 2min ;然后按照（94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向進行 15 個循環；最后 72°C延伸 10min。
[0038] 反應完成后，將上述PCR反應液稀釋50倍作為第二輪PCR擴增模板。第二 輪PCR反應：以AD和GSP2引物進行PCR擴增，反應程序為：按照（94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向進行 15個循環；最后72°C延伸10min。
[0039] 反應完成后，將上述PCR反應液稀釋50倍作為第三輪PCR擴增模板。第三 輪PCR反應：以AD和GSP3引物進行PCR擴增，反應程序為：按照（94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向進行 15個循環；最后72°C延伸10min。
[0040] 將三級PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1)，回收純化0. 8kb的目的條帶，將其連 接到PMD18-T載體（購自TAKARA公司），回收的目的片段與pMD-18T載體于16°C進行連接 2-6h，形成連接產物，連接反應體系如下：
[0041]

【權利要求】
1. 一種茶樹低溫誘導型啟動子，其特征在于：如SEQ ID NO. 1所示的DNA分子序列。
【文檔編號】C12N15/113GK104232642SQ201410359224
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】黎星輝, 杜昱林, 王玉花 申請人:南京農業大學