香樟低溫誘導CBF-like轉錄因子及其編碼蛋白、克隆方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種香樟低溫誘導CBF-like轉錄因子(包括CcCBFa基因和CcCBFb基因)及其編碼的氨基酸序列，CcCBFa基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；CcCBFb基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。利用香樟CcCBFa和CcCBFb基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化可獲得抗逆性改良，特別是抗寒性改良的轉基因新種質。本發明的內容對了解CBF基因在植物抗冷和其他逆境因子中的作用，對園林樹木抗逆分子輔助育種具有非常重要的意義。
【專利說明】香樟低溫誘導CBF-1 ike轉錄因子及其編碼蛋白、克隆方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學及園林植物育種【技術領域】，具體涉及一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子及其編碼蛋白、克隆方法和應用。
【背景技術】
[0002]樟樹又名香樟、烏樟,樟科樟屬Cinnamomum camphora L.;其樹冠廣展,濃蔭遍地，氣勢雄偉，是優良的行道樹及庭蔭樹；香樟在我國的分布大體以長江以北為界，南至兩廣及西南，以江西，浙江、福建等東南沿海省份為多，因而在栽培范圍上受到低溫的限制。近年來，為豐富北方園林的樹種組合，改善冬季園林植物景觀，香樟被引種栽植到黃河流域的一些省分。然而北方漫長而寒冷冬季往往導致香樟生長受損，嚴重時甚至樹體死亡，造成巨大的經濟損失。因此，防治凍害就成為這一優良樹種在北方城市順利推廣及應用的一個亟待解決的問題，解決這一問題的主要方法可采取加強栽培管理和選育抗寒新品種，而后者是根本途徑，但目前沒有相關報道。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子，具體涉及2個香樟抗逆相關的低溫誘導CBF-1i ke轉錄因子a(GenBank登錄號為KJ958932)和b (GenBank登錄號為 KJ958933) (Cinnnamomum camphora CBF-1ike transcript1n factor, CcCBFa andCcCBFb)基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列。為進一步研究香樟CBF-1ike基因的功能，以及CBF基因改良作物抗逆性，特別是改良抗寒性的應用奠定良好的基礎。
[0004]本發明的另一目的是提供一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子的編碼蛋白。
[0005]本發明的另一目的是提供一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子的克隆方法。
[0006]本發明的另一目的是提供一種上述的香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子在創建改良抗逆性植物基因工程株系中的應用。
[0007]本發明所采用的第一技術方案是，一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子，包括香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a(CcCBFa基因)和香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b (CcCBFb基因)，所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]本發明所采用的第二技術方案是，一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子編碼蛋白，包括香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a編碼蛋白和香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b編碼蛋白，所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0009]本發明所采用的第三技術方案是，一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子的克隆方法，具體按照以下步驟實施:
[0010]步驟1、香樟總RNA的提取；采用EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取香樟總RNA，所提RNA加入30-50ul DEPC處理水，充分溶解后于-80°C保存；
[0011]步驟2、反轉錄PCR;
[0012]步驟3、香樟CBF基因的3’ /5’ RACE克隆，并用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物；
[0013]其中，香樟CBF基因的3’ /5’ RACE克隆的反應條件為:
[0014]UPM = UPL (1uM) 2uI+UPS (1uM) 10ul+ddH2038ul
[0015]a).反應體系為50ul:
[0016]
【權利要求】
1.一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子，其特征在于，包括香樟低溫誘導CBF-1ikeR錄因子a (CcCBFa基因)和香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b (CcCBFb基因)，所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子的編碼蛋白，其特征在于，包括香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a編碼蛋白和香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b編碼蛋白，所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.一種香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子的克隆方法，其特征在于，具體按照以下步驟實施: 步驟1、香樟總RNA的提取；采用EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取香樟總RNA，所提RNA加入30-50ul DEPC處理水，充分溶解后于-80°C保存； 步驟2、反轉錄PCR; 步驟3、香樟CBF基因的3’ /5’ RACE克隆，并用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物； 其中，香樟CBF基因的3’ /5’ RACE克隆的反應條件為:
UPM = UPL(1uM)2uI+UPS (1uM)10ul+ddH2038ul a).反應體系為50ul:
b).反應條件: 94°C預變性 4min ;
;5 個循環
；30個循環；72 V總延伸1min ； 分別取上述PCR產物Iul溶于49ulddH20中，充分溶解混勻，做巢式PCR的樽板,(Template)； c).3’ /5’ RACE的巢式PCR擴增，反應體系為50ul:
d).巢式PCR反應條件: 94°C預變性 4min ； |94°(3變性30 8，64°C30s, 72°C1 min|; 35 個循環；72°C總延伸 1min ； 步驟4、PCR產物的膠回收，具體為:瓊脂糖凝膠電泳結束后，紫外燈下切下目的條帶，用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進行回收； 步驟5、PCR產物的克隆，A-T克隆； 步驟5.1、回收的目的產物與TaKaRa公司生產的pMD19_TVectorl6°C連接過夜，反應體系如下:
步驟5.2、大腸桿菌感受態細胞的轉化 將上述連接產物加于50ul Trans5 α大腸桿菌感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min，42°C熱激90s,冰浴5min,緩慢加入400ul新鮮液體LB, 37°C, 180rpm50min,吸取10ul菌液涂于添加有Amp100mg/L的LB平板上，置于37°C恒溫培養箱中，倒置過夜培養12_16h ； 步驟6、陽性重組子的篩選及鑒定；隨機挑取上述轉化平板中的陽性菌以PMD19-T載體通用引物M13上、下游引物進行菌落PCR，將PCR擴增產物置于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測正確的陽性菌接種于Iml添加有Amp100mg/L的液體LB中搖菌培養，送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結果進行拼接，從而獲得2個香樟CBF-1ike基因的全長cDNA(CcCBFa和CcCBFb)序列，其核苷酸序列分別為:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 ； 步驟7、對步驟6中的香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a和香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b使用DNAman分子軟件分析，得香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子a編碼蛋白序列和香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子b編碼蛋白序列，其氨基酸序列分別為:SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。
4.根據權利要求2所述的香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子的克隆方法，其特征在于，通過RACE技術采用于下述的引物，獲得所述基因的3’及5’核苷酸序列，拼接后獲得2個香樟CBF-1ike基因的全長cDNA序列: CcCBF3’ GSPl:TCGGCGTGGCTCTTGCCAAT，其核苷酸序列如:SEQ ID N0.5 所示； CcCBF3’ GSP2:TCTGCTAGCGCCAAGGACAT，其核苷酸序列如:SEQ ID N0.6 所示；
CcCBF5’ GSPl:ATGTCCTTGGCGCTAGCAGA，其核苷酸序列如:SEQ ID N0.7 所示； CcCBF5’ GSP2:ATTGGCAAGAGCCACGCCGA，其核苷酸序列如:SEQ ID N0.8 所示；。
5.一種如權利要求1所述的香樟低溫誘導CBF-1ike轉錄因子在創建改良抗逆性植物基因工程株系中的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK104130320SQ201410346982
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】杜麗, 李勇鵬, 姚瑤, 張力維 申請人:南陽師范學院