專利名稱：低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展用于動(dòng)態(tài)測量藥物影響細(xì)胞鋪展的方法
低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展用于動(dòng)態(tài)測量藥物影響細(xì)胞鋪展的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是用于測量各種藥物對(duì)貼壁細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)的影響的方法。技術(shù)背景
細(xì)胞鋪展是貼壁細(xì)胞的重要生理活動(dòng)或功能之一，許多人體生理活動(dòng)或疾病與細(xì)胞的鋪展有關(guān)。例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過細(xì)胞的鋪展來構(gòu)建血管內(nèi)壁或者修補(bǔ)破損的血管內(nèi)皮層，因此，內(nèi)皮細(xì)胞鋪展的改變往往與心血管疾病的產(chǎn)生、發(fā)展和腫瘤轉(zhuǎn)移等有關(guān)，而藥物對(duì)細(xì)胞鋪展的影響也必然是評(píng)估藥物療效的體外細(xì)胞試驗(yàn)中的重要指標(biāo)之一。
目前，有直接和間接兩種方法來測定藥物對(duì)細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)的影響。前者是將藥物直接加入已經(jīng)鋪展完全或鋪展中的細(xì)胞，再測量藥物對(duì)細(xì)胞鋪展的影響；后者是先將藥物加入鋪展完全的細(xì)胞中共同孵育一段時(shí)間，然后去除溶液中的藥物并用試劑誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展，再觀察細(xì)胞再次鋪展的能力。
胰蛋白酶常被用作細(xì)胞去鋪展的試劑。然而，胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞膜表面的各種蛋白有較大的損傷作用，而且還不清楚是否會(huì)對(duì)細(xì)胞的各種生理活動(dòng)(如細(xì)胞鋪展等)產(chǎn)生影響，因而，這種生化方法會(huì)使得藥物影響細(xì)胞鋪展的研究和分析更加復(fù)雜化，迫切需要更加溫和、無副作用、同時(shí)又有效的細(xì)胞去鋪展的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展用于動(dòng)態(tài)測量藥物影響細(xì)胞鋪展的方法，本發(fā)明簡單、快速、溫和、有效地誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展并動(dòng)態(tài)觀察和測定藥物對(duì)細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)的影響的方法，以取代胰蛋白酶去鋪展的方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
(1)將處于懸浮狀態(tài)的貼壁細(xì)胞種植在培養(yǎng)孔或板上，在培養(yǎng)箱中孵育，讓細(xì)胞完全鋪展開。
(2)加入藥物與細(xì)胞共孵育20min-lh，隨后去除藥物。
(3)將藥物處理的細(xì)胞放置于顯微鏡下，拍攝細(xì)胞去鋪展之前的形貌圖像。
(4)吸去水溶液，加入4°C的細(xì)胞培養(yǎng)液或緩沖液。
(5)立即用顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的去鋪展?fàn)顟B(tài)，每隔幾分鐘連續(xù)獲取細(xì)胞形貌圖像，約持續(xù)30min-lh。
(6)用軟件測量出每個(gè)細(xì)胞的貼壁面積或者每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有細(xì)胞的貼壁面積平均值。
(7)將上述過程得到的數(shù)據(jù)與空白對(duì)照的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析，得到藥物影響細(xì)胞鋪展的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明所述的步驟(3)中，所述的顯微鏡優(yōu)選能控制溫度在37°C的共聚焦顯微^Mi ο
本發(fā)明的主要特點(diǎn)是。
(1)過程簡單。觀察或測量前只需加入低溫的培養(yǎng)液或緩沖液就可以。
(2)對(duì)細(xì)胞無損傷。沒有添加任何的生物或化學(xué)試劑。
(3)檢測快速。基本上可以在1小時(shí)內(nèi)測定。而直接測量方法要用時(shí)幾個(gè)小時(shí)甚至對(duì)小時(shí)。
( 4 )可動(dòng)態(tài)觀察或測量。由于用時(shí)比較短，可動(dòng)態(tài)觀察整個(gè)去鋪展過程或藥物的影響。
(5)有效。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示(在具體的實(shí)施方案中)，這種方法可以檢測出藥物對(duì)細(xì)胞鋪展的影響。具體實(shí)施方案
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明所述的實(shí)施例所使用的成像設(shè)備為德國產(chǎn)的Carl Zeiss 710激光共聚焦顯微鏡，其中細(xì)胞貼壁面積的測量，是使用該顯微鏡的面積測量功能(該顯微鏡自帶的LSM 710 Release Version 5. 5 sp2 軟件)。
實(shí)施例1 低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展的定量測量。
將懸浮的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞種植在含有培養(yǎng)液的M孔板上，放置于(X)2培養(yǎng)箱 (37°C，5% CO2)中培養(yǎng)。培養(yǎng)M小時(shí)后，將細(xì)胞放置于共聚焦顯微鏡自帶的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中 (37°C，5% C02)，用共聚焦顯微鏡觀察并獲取某個(gè)視野的細(xì)胞形貌圖像。加入溫度為4°C的培養(yǎng)液，立即使用共聚焦顯微鏡自帶的動(dòng)態(tài)觀察軟件，每隔1分鐘自動(dòng)掃描一次同一個(gè)視野的細(xì)胞形貌圖像。用該顯微鏡自帶的測量軟件測量出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)圖像中所有單個(gè)細(xì)胞的貼壁面積并計(jì)算出平均值。這里只給出每個(gè)5分鐘時(shí)的數(shù)據(jù)。計(jì)算得出低溫處理前細(xì)胞的平均鋪展面積為巧45. 4士368. 8 um2 ；低溫處理后1分鐘面積降為1384. 7士332. 1 um2 ；隨后，前15分鐘細(xì)胞平均面積迅速分別下降為1239. 3士四6.0 um2(第5分鐘)、1112. 7士洸9. 6 um2 (第10分鐘)、1069. 1士對(duì)5. 6 um2 (第15分鐘)；之后的15分鐘基本保持不變，分別為 1086. 6 士 258. 0 um2 (第 20 分鐘)、1078. 4士 278. 9 um2 (第 25 分鐘)、1002. 6 士 252. 0 um2 (第 30分鐘)。數(shù)據(jù)顯示，細(xì)胞在低溫處理后發(fā)生了去鋪展現(xiàn)象，且主要發(fā)生在0-15分鐘內(nèi)，下降幅度約為500 um2。
實(shí)施例2 低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展用于測量藥物對(duì)細(xì)胞鋪展的影響的定量測量。
實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)驗(yàn)例1基本相同，只是在培養(yǎng)細(xì)胞M小時(shí)后，將藥物(10ug/ml神經(jīng)節(jié)苷脂GMl)加入，與細(xì)胞共培育30分鐘后去除藥物并換新鮮的培養(yǎng)液，將樣品放置于顯微鏡下低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展并動(dòng)態(tài)觀察和測量。計(jì)算得出藥物處理的細(xì)胞在低溫處理前的平均鋪展面積為1053. 9士396. 8 um2 ；低溫處理后1分鐘面積為983. 8士350. 9 um2 ； 此后，每隔5分鐘分別為933. 0士四8. 4 um2 (第5分鐘)、702. 9士洸6. 9 um2 (第10分鐘)、 640. 7 士 240. 5 um2 (第 15 分鐘)、605· 5 士 221. 1 um2 (第 20 分鐘)、593· 5 士 213. 6 um2 (第 25 分鐘)、643.9士對(duì)0.3 um2 (第30分鐘)。數(shù)據(jù)顯示，藥物作用的細(xì)胞在低溫處理后也發(fā)生了去鋪展現(xiàn)象，主要發(fā)生在5-15分鐘內(nèi)，與對(duì)照(實(shí)施例1 ；發(fā)生在0-15分鐘內(nèi))相比稍微滯后；下降幅度約為400 um2，比對(duì)照(約500 um2)稍小。數(shù)據(jù)比對(duì)說明了藥物GMl能夠抑制這種細(xì)胞的鋪展，這與文獻(xiàn)報(bào)道的用其它方法得到的結(jié)論完全相符。
權(quán)利要求
1.一種低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展用于動(dòng)態(tài)測量藥物影響細(xì)胞鋪展的方法，其特征是按以下步驟(1)將處于懸浮狀態(tài)的貼壁細(xì)胞種植在培養(yǎng)孔或板上，在培養(yǎng)箱中孵育，讓細(xì)胞完全鋪展開；(2)加入藥物與細(xì)胞共孵育20min-lh，隨后去除藥物；(3)將藥物處理的細(xì)胞放置于顯微鏡下，拍攝細(xì)胞鋪展之前的形貌圖像；(4)吸去水溶液，加入4°C的細(xì)胞培養(yǎng)液或緩沖液；(5)立即用顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的去鋪展?fàn)顟B(tài)，每隔幾分鐘連續(xù)獲取細(xì)胞形貌圖像，約持續(xù) 30min-lh ；(6)用軟件測量出每個(gè)細(xì)胞的貼壁面積或者每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有細(xì)胞的貼壁面積平均值；(7)將上述過程得到的數(shù)據(jù)與空白對(duì)照的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析，得到藥物影響細(xì)胞鋪展的數(shù)據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展用于動(dòng)態(tài)測量藥物影響細(xì)胞鋪展的方法，其特征是步驟(3)中，所述的顯微鏡選擇能控制溫度在37°C的共聚焦顯微鏡。
全文摘要
一種低溫誘導(dǎo)細(xì)胞去鋪展用于動(dòng)態(tài)測量藥物影響細(xì)胞鋪展的方法，其特征是按以下步驟將處于懸浮狀態(tài)的貼壁細(xì)胞種植在培養(yǎng)孔或板上，在培養(yǎng)箱中孵育，讓細(xì)胞完全鋪展開；加入藥物與細(xì)胞共孵育20min-1h，隨后去除藥物；將藥物處理的細(xì)胞放置于顯微鏡下，拍攝細(xì)胞鋪展之前的形貌圖像；吸去水溶液，加入4℃的細(xì)胞培養(yǎng)液或緩沖液；立即用顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的去鋪展?fàn)顟B(tài)，每隔幾分鐘連續(xù)獲取細(xì)胞形貌圖像，約持續(xù)30min-1h；用軟件測量出每個(gè)細(xì)胞的貼壁面積或者每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有細(xì)胞的貼壁面積平均值；將上述過程得到的數(shù)據(jù)與空白對(duì)照的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析，得到藥物影響細(xì)胞鋪展的數(shù)據(jù)。本發(fā)明過程簡單、對(duì)細(xì)胞無損傷、檢測快速、可動(dòng)態(tài)觀察或測量、效果好。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102517371SQ20111040599
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者曾芳發(fā), 邵文祥, 陳勇, 黃潔 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)