一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。苯丙氨酸脫氨酶基因的克隆對采用酶法生物合成L-苯丙氨酸具有重要的作用。本發(fā)明所述的苯丙氨酸脫氨酶基因是通過提取粘紅酵母的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得全長的苯丙氨酸脫氨酶基因，該基因全長2121bp，編碼705個氨基酸。本發(fā)明進一步擴大了苯丙氨酸脫氨酶基因資源，為分子改造苯丙氨酸脫氨酶，提高酶的穩(wěn)定性和催化活性提供了科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]苯丙氨酸脫氨酶(PAL)在pH8.0時催化L-苯丙氨酸(L_phe)脫氨生成反式肉桂酸和氨，pHll.0時能催化逆向反應(yīng)合成L-phe，工業(yè)上利用這一特性，生產(chǎn)人體必須氨基酸L-phe和甜味劑阿斯巴甜。PAL廣泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌，尤其是紅酵母屬中。其中粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉價的原料如玉米粉，糖漿，糖蜜，豆柏，味精廢水等工業(yè)廢料上生長，容易實現(xiàn)大規(guī)模的培養(yǎng)，已經(jīng)成功應(yīng)用于食品、制藥等工業(yè)領(lǐng)域。但是由于該酶是誘導(dǎo)酶，在對數(shù)生長期酶活達到峰值后，酶活下降較快，穩(wěn)定性差。
[0003]為進一步提高酶活和穩(wěn)定性，需要采用分子生物手段對酶進行分子改造，但到目前為止，僅僅獲得PAL的部分cDNA，缺少5’端的基因序列。由于該基因的5’端序列的GC含量高，容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄很難成功。
[0004]為此，本發(fā)明提供了一種粘紅酵母PAL全長的基因序列，經(jīng)表達，獲得4.2U/mgPAL。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0006]所述苯丙氨酸脫氨酶基因是以工業(yè)生產(chǎn)用菌株粘紅酵母為出發(fā)菌株，分離其總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得苯丙氨酸脫氨酶的cDNA，最終獲得全長為2121bp的基因序列，編碼706個氨基酸，酶活達到4.2U/mg，是目前已報到的最高酶活。
[0007]苯丙氨酸脫氨酶基因編碼的苯丙氨酸脫氨酶可用于催化生產(chǎn)L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。
[0008]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種表達所述苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌。優(yōu)選以大腸桿菌為宿主，以 pET-22b (+)、pET-23 (+)、pET_28a (+)或 pET_20b (+)為表達載體。進一步優(yōu)選將獲得的基因與載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)-pal，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21。
[0009]本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種表達所述基因獲得苯丙氨酸脫氨酶的方法。優(yōu)選以大腸桿菌為宿主，以pET-22b(+)、pET-23 (+)、pET-28a(+)或pET_20b (+)為表達載體。進一步優(yōu)選將獲得的基因與載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)-pal，轉(zhuǎn)化E.coli BL21后誘導(dǎo)表達該基因。
[0010]所述方法進一步優(yōu)選將帶有pET-28-pal的重組大腸桿菌培養(yǎng)至0D_為0.6時加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.4mM,于24°C培養(yǎng)12h后離心收集菌體，用含有1mM的咪唑、150mM氯化鈉，pH7.5的50mM的磷酸緩沖液洗滌2次，然后采用超聲破碎細胞30min后離心收集上清，上清用帶有His標(biāo)簽的親和層析柱純化，用含250mM咪唑、150mM NaC, pH7.5的磷酸緩沖液進行洗脫，收集目的蛋白。將收集的目的蛋白用脫鹽柱脫鹽得到純化后的PAL。
[0011]本發(fā)明提供了一種完整的新的粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因，編碼的苯丙氨酸脫氨酶酶活達到4.2U/mg，是目前已報到的最高酶活。該基因的獲得為進一步利用分子生物學(xué)手段對酶進行改造，以提高酶活及其穩(wěn)定性提供了基礎(chǔ)。所得苯丙氨酸脫氨酶及相應(yīng)基因工程菌都可以應(yīng)用于生產(chǎn)L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為粘紅酵母總RNA的電泳圖。
[0013]圖2為反轉(zhuǎn)錄后PCR擴增全長基因的電泳圖。
[0014]圖3為粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶的閱讀框及翻譯的氨基酸序列。
[0015]圖4為重組酶的表達；M,蛋白marker ；1,不帶重組質(zhì)粒pET-28-pal的E.coilBL21全細胞電泳；2，帶重組質(zhì)粒pET-28-pal，未用IPTG誘導(dǎo)的E.coil BL21全細胞電泳；3，帶重組質(zhì)粒pET-28-pal，IPTG誘導(dǎo)的E.coil BL21全細胞電泳。
[0016]圖5SDS-PAGE檢測純化的蛋白；M，為蛋白marker ;1，全細胞電泳；2，采用His純化柱純化后獲得的PAL。
[0017]圖60.5mM反式肉桂酸標(biāo)樣的HPLC圖(出峰時間為6.35min)。
[0018]圖7重組酶催化L-苯丙氨酸后HPLC分析(在6.25min出現(xiàn)產(chǎn)物峰，與標(biāo)樣出峰時間一致)。

【具體實施方式】
[0019]實施例1提取粘紅酵母總RNA
[0020](I)以工業(yè)生產(chǎn)用菌株粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)CCTCC N0:M2011490為出發(fā)菌株，從粘紅酵母平板上挑取單菌落至5mL的種子培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)24h后，取50 μ L的種子液至裝有50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C培養(yǎng)18_20h至OD6tltl = 1.0，1500g離心5min收集菌體，用冷水將菌體洗滌2次，棄上清。
[0021](2)用 400μ L 的 TES(10mM Tris-HCI, 1mM EDTA,0.5% SDS, pH7.5)緩沖液重懸細胞，加入400 μ L酸性酚，劇烈震蕩10sec，65°C溫育lh，不時用渦旋振蕩器短暫震蕩。
[0022](3)冰育 5min,于 4°C, 12000g 離心 5min。
[0023](4)將水相移至另一 1.5mL的離心管中，加入400 μ L酸性酚，劇烈震蕩lOsec，重復(fù)步驟(3)。
[0024](5)將水相移至另一 1.5mL的離心管中，加入氯仿，劇烈震蕩lOsec，于4°C，12000g離心5min。
[0025](6)將水相移到新的1.5mL離心管中，加入40 μ I的3Μ NaAc及Iml冰冷的無水乙醇，于 4°C，12000g 離心 5min。
[0026] (7)加入lmL，75%乙醇快速震蕩洗滌RNA沉淀。
[0027](8)沉淀于無菌操作臺上風(fēng)吹15min至酒精揮發(fā)完全，加入經(jīng)DEPC處理的無菌水50 μ L重懸，-80°c保藏備用，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量(圖1)。
[0028]實施例2反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
[0029](I)于 0.5mL 的離心管中加入 50ng 總 RNA，lyL5’ _CDS(5’ -(T)25VN(N=A, C, G, T ；V = A，G，C)-3，)和 IyL SMARTer II A Oligonucleotide (5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGGGG - 3’)，加水至 4.75 μ L 混勻。
[0030](2) 72°C溫育 3min 后于 42°C溫育 2min，1500g 離心 lOsec。
[0031](3)力卩 Λ 2μ L5Xbuffer (250Mm Tris-HCI, 375mM KCl, 30mM MgCl2)，I μ L 的DTT (20mM)，I μ L dNTP (1mM)，0.25 μ L RNase 抑制劑和 I μ L SMARTer? 反轉(zhuǎn)錄酶，42。。溫育90min后于70°C變性lOmin，冷卻至室溫加入20 μ L無菌水，獲得cDNA。
[0032]實施例3獲得pal5’端的序列
[0033](I)往 0.25mL 的離心管加入 I μ L cDNA、5 μ L Mix 引物(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ ；5’ - CTAATACGACTCACTATAGGGC - 3’)，I μ L GSP 特異性引物(5，-GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3'), 5 μ LlO Xbuffer, 5 μ L dNTP (2mM)，0.5 μ Lpfu DNA聚合酶，3 μ L MgSO4 (25mM)，加去離子水至50 μ L。
[0034](2)進行PCR擴增，PCR擴增條件:94 V預(yù)變性4min，94 V變性Imin，58 °C退火30sec,72°C延伸60sec,2 5個循環(huán),瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0035](3)往 0.25mL 的離心管中加入 5 μ L PCR 產(chǎn)物，I μ LlOXTaq buffer, I μ LdATP (2mM), I μ L Taq SI (5U/ μ L)加水至10 μ L，70°C反應(yīng)30min后酚仿抽提，乙醇沉淀，無菌操作臺風(fēng)吹15min至酒精揮發(fā)完全，用10 μ L無菌水重懸。
[0036](4)取上一步反應(yīng)液 5 μ L，加入 I μ L 連接 buffer，lyL50% PEG, I μ L pUCm-T 載體，IyL T4連接酶，加去離子水至10 μ L，于16 °C過夜連接。
[0037](5)取連接產(chǎn)物 10 μ L，10 μ L5 X KCM (0.5Μ KCl，0.15Μ CaCl2, 0.25Μ MgCl2)，去離子水30 μ L，加至50 μ L的E.coli JM109感受態(tài)中，冰浴30min，42°C熱擊90sec，冰浴2min，加入100 μ L的新鮮LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)30_60min，取100 μ L涂布含有氨芐青霉素(50ug/mL)的LB平板，37°C培養(yǎng)10h，挑取單菌落，接入5mL含50ug/mL的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)10h，取2mL菌液提質(zhì)粒進行測序，獲得5’端的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0038]實施例4構(gòu)建克隆載體pUCm-T-pal
[0039](I)根據(jù)步驟3獲得的5’端序列，設(shè)計一對特異性引物(primer F:5’-GGAATTCCATATGATGGCCCCC TCCGTCGACTCGATC-3’ ；primer R:5’-CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3’),0.25mL 的離心管加入 I μ L cDNA, primer F 和 R 各 I μ L，5μ L10Xbuffer,5y L dNTP(2mM),0.5 μ L pfu DNA 聚合酶，加去離子水至 50 μ L。
[0040](2)進行PCR擴增，PCR擴增條件:94 V預(yù)變性4min，94 V變性Imin，58 °C退火30sec，72°C延伸2min，25個循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。
[0041](3)參照實施例3，將擴增到全長基因序列與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)入E.coli JM109，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，挑單菌落至LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)10h，取2mL菌液提質(zhì)粒進行測序，獲得全長的序列，采用PCR驗證構(gòu)建的pUCm-T-pal，分析閱讀框(圖3)，從圖中可知該酶的閱讀框全長2121bp，編碼706個氨基酸。
[0042]實施例5構(gòu)建表達載體pET_28a (+) -pal表達PAL
[0043]Ndel和EcoRl分別對pUCm-T-pal和空載體pET_28a(+)進行雙酶切，膠回收后于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑陽性重組子，提取重組質(zhì)粒并進行PCR和雙酶切驗證，陽性克隆即pET-28a(+) -pal。
[0044]取IyL pET-28a(+)-pal，轉(zhuǎn)入 E.coli BL21，取 100 μ L 涂布含有卡那霉素(50 μ g/mL)的LB平板，37°C培養(yǎng)10h，挑取單菌落至5mL的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)10h，取ImL培養(yǎng)液至10mL的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD6tltl為0.6時加入終濃度為0.4mM的IPTG，26°C誘導(dǎo)表達12h后離心收集菌體，進行SDS-PAGE檢測表達情況，結(jié)果見圖4，從圖中可知，該基因成功表達。目的條帶的分子量70kD左右，與理論分子量大小一致。
[0045]實施例6重組PAL的純化
[0046]將帶有pET-28a(+)_pal的重組大腸桿菌培養(yǎng)至OD6tltl為0.6時加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.4mM,于24°C培養(yǎng)12h后離心收集菌體，用50mM的磷酸緩沖液(含有1mM的咪唑，150mM氯化鈉，pH7.5)洗滌2次，然后采用超聲破碎細胞30min后離心收集上清，上清用帶有His標(biāo)簽的親和層析柱(HisTrap FF crude column ImL)純化,用含58.3%咪唑的磷酸緩沖液(250mM咪唑，150mM NaC，pH7.5)進行洗脫，收集目的蛋白。將收集的目的蛋白用脫鹽柱(HiPrep26/10desalting column)脫鹽。SDS-PAGE檢測純化的蛋白，結(jié)果如圖5,從圖中可知，獲得高純度的PAL蛋白，蛋白的大小與理論一致。
[0047]實施例7 HPLC測定酶的活性
[0048]取適量的實施例6得到純酶與40mM的L-苯丙氨酸于40°C下反應(yīng)30min后加入50%的甲醇終止反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后用0.22 μ m的纖維素膜過濾后進行HPLC分析。HPLC測定條件:日立C18柱，50%甲醇作為流動相，流速0.5ML/min,進樣10 μ L。標(biāo)準(zhǔn)樣品及酶催化后的HPLC圖譜如圖6和7，從圖中可知，該重組酶具有催化苯丙氨酸生成肉桂酸的功能。純酶的比酶活達到4.2U/mg，是目前已報道的最高活性。
[0049] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種苯丙氨酸脫氨酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的苯丙氨酸脫氨酶。
3.攜帶權(quán)利要求1所述基因的載體、重組細胞或基因工程菌。
4.一種獲得權(quán)利要求1所述基因的方法，其特征在于，以粘紅酵母為出發(fā)菌株，分離其總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得苯丙氨酸脫氨酶的cDNA，最終獲得全長基因序列。
5.一種表達權(quán)利要求1所述苯丙氨酸脫氨酶基因的基因工程菌，其特征在于，將苯丙氨酸脫氨酶基因與載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)-pal，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，篩選獲得陽性菌株。
6.一種表達權(quán)利要求1所述苯丙氨酸脫氨酶基因的方法，其特征在于，以大腸桿菌為宿主，以 pET-22b (+)、pET-23 (+)、pET_28a (+)或 pET_20b (+)為表達載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將編碼丙氨酸脫氨酶的基因與載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)-pal，轉(zhuǎn)化Ε.coli BL21后誘導(dǎo)表達該基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，將帶有pET-28a(+)-pal的重組大腸桿菌培養(yǎng)至0D_為0.6時加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.4mM,于24°C培養(yǎng)12h后離心收集菌體；用含有1mM的咪唑 、150mM氯化鈉、pH7.5的50mM的磷酸緩沖液洗滌，然后超聲波破碎細胞后離心收集上清；上清用帶有His標(biāo)簽的親和層析柱純化，用含250mM咪唑、150mM NaCl,PH7.5的磷酸緩沖液進行洗脫，收集目的蛋白；將收集的目的蛋白脫鹽得到純化后的PAL。
9.權(quán)利要求2所述苯丙氨酸脫氨酶在生產(chǎn)L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求5所述基因工程菌在生產(chǎn)L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK104131017SQ201410362681
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】周哲敏, 朱龍寶, 崔文璟, 周麗 申請人:江南大學(xué)