一種連續低劑量輻射富集腫瘤干細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及一種連續低劑量輻射富集腫瘤干細胞的方法，所述方法包括培養癌細胞系，經過低劑量輻射處理，培養一段時間后，再次接受低劑量輻射處理，共計輻射n次，即可富集細胞系中的腫瘤干細胞，提高腫瘤干細胞比例。所述癌細胞系優選為乳腺癌細胞系。所述低劑量輻射處理優選為通過60Co進行低劑量輻射處理。所述低劑量優選為1.5-3Gy，更優選為2Gy。所述培養一段時間優選為培養1-2周。所述共計輻射n次優選為共計輻射三次。本發明提供了一種非常簡單、實用的富集腫瘤干細胞的方法，為后續進一步研究腫瘤干細胞的特性開拓了新途徑。
【專利說明】一種連續低劑量輻射富集腫瘤干細胞的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種連續低劑量輻射富集腫瘤干細胞的方 法。

【背景技術】
[0002] 腫瘤是一群異質性細胞的集合體，其中存在一群具有較強自我更新能力和致瘤 能力的細胞亞群，人們將其定義為腫瘤干細胞（Cancer Stem Cells)。腫瘤干細胞理論認 為，在原發腫瘤病灶處存在一定量的腫瘤干細胞，經過手術、化療和放療等常規治療后，雖 然能夠殺死幾乎全部的腫瘤細胞，但是還存留有一定的腫瘤干細胞，由于腫瘤干細胞具有 很強的自我更新能力，會在原病灶處重新產生腫瘤，使疾病復發，同時腫瘤干細胞能夠在機 體內轉移，形成轉移灶（見 Vermeulen, L.，Sprick, M. R.，Kemper, K.，Stassi, G. &Medema，J. P. Cancer stem cells--〇1d concepts,new insights. Cell Death Differ 15, 947-958, 2008 和 Clarke，M. F. et al. Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions:AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer research 66, 9339-9344, 2006)。因此對腫瘤干細胞的深入研究有助于理解腫瘤的發生、發展及轉移 的分子機制，對腫瘤的檢測及治療具有重要的臨床意義。
[0003] 腫瘤干細胞在腫瘤中的比例極小，利用現有的分離方法，如利用特定腫瘤細胞表 面的特異性抗原分子標記，只能從大量的腫瘤組織或腫瘤細胞系中獲取極少量的腫瘤干細 胞進行生物學研究，在一些需要樣品量較多的實驗上，樣品獲取就更加不易。
[0004] 關于腫瘤干細胞與輻射之間的關系，2006年，Pajonk，F.及其研究團隊發現 ⑶44 +CD24_/lOT細胞對輻射具有抗性，并且乳腺癌細胞在經歷連續低劑量處理之后，其中 的 CD44+CD24-/1? 細胞比例能夠得到提升（見 Phi 11 ips, Τ· M.，Mcfcide, W. H. &Pa jonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute 98, 1777-1785, 2006)。2012 年，Yawei Yuan及其同事的研究也發現自我更新能力強的細胞表現出更強的耐輻射能力（見Xie，G. et al. Mammosphere cells from high-passage MCF7cell line show variable loss of tumorigenicity and radioresistance. Cancer letters 316, 53-61，2012) 〇 因此，在現有 的研究基礎之上，發明人模擬臨床放射治療手段，充分研究腫瘤干細胞富集與連續低劑量 輻射之間的關系，旨在發明一種切乎實際的富集腫瘤干細胞的手段，用以改變本研究領域 腫瘤干細胞樣品稀少的局面。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種切乎實際的富集腫瘤干細胞的方法。
[0006] 為了達到上述目的，本發明提供一種連續低劑量輻射富集腫瘤干細胞的方法。
[0007] 所述方法包括培養癌細胞系，經過低劑量輻射處理，培養一段時間后，再次接受低 劑量輻射處理，如此重復輻射，共計輻射η次，即可富集細胞系中的腫瘤干細胞，提高腫瘤 干細胞比例。η為大于或等于1的整數。
[0008] 優選地，所述癌細胞系為乳腺癌細胞系。
[0009] 優選地，所述低劑量輻射處理為通過6°Co進行低劑量輻射處理。
[0010] 優選地，所述低劑量為1. 5-3Gy。
[0011] 優選地,所述低劑量為2Gy。
[0012] 優選地，所述培養一段時間為培養1-2周。
[0013] 優選地，所述共計輻射η次為共計輻射三次。
[0014] 可以通過以下至少三種方法鑒定腫瘤干細胞是否得到富集：
[0015] 鑒定方法一：
[0016] 將分別經過連續低劑量處理的細胞系進行生物學鑒定，首先是通過抗體識別乳腺 癌腫瘤干細胞表面特異性抗原⑶44+⑶24_/1<w，利用流式細胞儀對細胞系中⑶44+⑶24_A° W的 比例進行分析，若細胞系中的CD44+CD24-/lOT比例得到提升，則說明細胞系中腫瘤干細胞得 到了有效富集。
[0017] 鑒定方法二：
[0018] 將經過連續低劑量處理的細胞系進行生物學鑒定，利用腫瘤干細胞鑒定的"金標 準"--小鼠成瘤實驗對富集得到的腫瘤干細胞進行鑒定；將一定數目的細胞注射到免疫 系統缺陷的小鼠體內，觀察并統計其成瘤情況。理論上講，腫瘤干細胞的比例得到提升之后 細胞群體的致瘤能力增強，所以在小鼠體內成瘤所需的細胞數目就會減少，因此只要實驗 數據與理論數據趨勢相一致，則說明細胞系中的腫瘤干細胞得到了有效富集。
[0019] 鑒定方法三：
[0020] 將經過連續低劑量處理的細胞系進行生物學鑒定，根據腫瘤干細胞自我更新能力 增強的特性，對經過連續低劑量處理的細胞系進行懸浮培養以及對細胞中干性因子進行檢 測，若分析得到經過多次照射的細胞系的自我更新能力較強且其中的干性因子表達量明顯 升高，則說明細胞系中的腫瘤干細胞得到了有效富集。
[0021] 本發明的有益效果：
[0022] 本發明提供了一種非常簡單、實用的富集腫瘤干細胞的方法，為后續進一步研究 腫瘤干細胞的特性開拓了新途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為乳腺癌細胞系在經過連續低劑量輻射之后細胞的⑶44+CD24_A° w的比例統 計分析結果。
[0024] 圖2為乳腺癌細胞系MDA-MB-231在經過連續低劑量輻射之后細胞干性因子的 q-PCR定量分析結果。
[0025] 圖3為乳腺癌細胞系MCF7在經過連續低劑量輻射之后細胞干性因子的q-PCR定 量分析結果。
[0026] 圖4為乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF7在經過連續低劑量輻射之后細胞利用懸 浮培養系統鑒定其自我更新能力實驗結果。

【具體實施方式】
[0027] 以下實施例用于舉例說明本發明，其并不用于限制本發明。
[0028] 實施例1 MDA-MB-231腫瘤干細胞的富集
[0029] 常規實驗室條件下培養乳腺癌細胞系MDA-MB-231，經過同位素6°Co放射源、2Gy照 射處理（以139. 09cGy/min的劑量處理1:17min)，處理后常規培養1-2周，待細胞生長狀況 穩定，再次接受6°C 〇、2Gy照射處理，如此重復照射，分別收集輻射l*2Gy、2*2Gy和3*2Gy的 細胞（n*2Gy)。
[0030] 實施例2 MCF7腫瘤干細胞的富集
[0031] 常規實驗室條件下培養乳腺癌細胞系MCF7,經過同位素6°Co放射源、2Gy照射處理 (以139. 09cGy/min的劑量處理1:17min)，處理后常規培養1-2周，待細胞生長狀況穩定， 再次接受6°C 〇、2Gy照射處理，如此重復照射，分別收集輻射l*2Gy、2*2Gy和3*2Gy的細胞 (n*2Gy)。
[0032] 實施例3流式細胞術分析腫瘤干細胞的富集
[0033] 將實施例1和2所獲得的細胞，分別通過⑶24-APC和⑶44-FITC兩種抗體對細胞 進行孵育，利用流式細胞儀分析發現在兩種細胞系中連續低劑量輻射能將CD44 +CD2€/lw的 比例提升，尤其是在MCF7細胞系中，腫瘤干細胞的比例升高將近10倍，因此說明利用連續 低劑量輻射乳腺癌細胞系是能夠提高其中的腫瘤干細胞比例（見圖1)。
[0034] 上述流式細胞術實驗過程簡述如下：利用流式細胞儀分選的方法，首先分別收集 不同批次處理的細胞，用磷酸緩沖液PBS清洗干凈之后，用⑶24-APC和⑶44-FITC兩種抗 體對細胞進行孵育，分別選用635nm和488nm激發光，對比陰性對照和單陽對照進行象限分 析。
[0035] 實施例4通過干性因子mRNA水平分析腫瘤干細胞的富集
[0036] 為了確定連續低劑量輻射之后細胞中多種干性因子的表達水平，發明人利用實時 定量Real-Time RT-PCR方法對實施例1和2所獲得的細胞中的干性因子mRNA水平進行 了檢測。檢測結果顯示：MDA-MB-231細胞系在連續低劑量照射兩次之后，干性因子0CT4/ S0X2/KLF4等均有不同水平的顯著性升高，其中S0X2因子更是比對照組高出7倍之多； MCF7細胞系則是在經過一次低劑量照射之后，細胞中的干性因子就有明顯的增高，其中的 NAN0G因子超過對照組18倍（見圖2、圖3)。
[0037] 實施例5懸浮培養分析腫瘤干細胞的富集
[0038] 為了確定利用連續低劑量輻射之后富集得到的是否為腫瘤干細胞，因此根據腫瘤 干細胞具有較強的自我更新能力這一特性，發明人利用懸浮培養體系來檢測細胞系的自我 更新能力。實驗流程如下：首先通過正常培養體系得到各種經過連續低劑量處理的細胞系， 用培養基稀釋到一定比例，利用血球計數板計數，接種細胞密度為10, 〇〇〇/ml進行懸浮培 養，生長7天之后，觀察并統計各種處理細胞的成球情況。根據觀察統計，可以看出兩種細 胞系在接受連續低劑量輻射之后細胞的自我更新能力都得到明顯增強，說明細胞系中的腫 瘤干細胞得到了有效富集（見圖4)。
[0039] 以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技 術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修 改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種連續低劑量輻射富集腫瘤干細胞的方法，其特征在于： 培養癌細胞系，經過低劑量輻射處理，培養一段時間后，再次接受低劑量輻射處理，如 此重復輻射，共計輻射η次；η為大于或等于1的整數。
2. 根據權利要求1所述的方法，所述癌細胞系為乳腺癌細胞系。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，所述低劑量輻射處理為通過6°Co進行低劑量輻射 處理。
4. 根據權利要求3所述的方法，所述低劑量為1. 5-3Gy。
5. 根據權利要求4所述的方法，所述低劑量為2Gy。
6. 根據權利要求3所述的方法，所述培養一段時間為培養1-2周。
7. 根據權利要求3所述的方法，所述共計輻射η次為共計輻射三次。
8. 根據前述任一項所述的方法，還包括鑒定腫瘤干細胞是否得到富集的步驟。
【文檔編號】C12N13/00GK104152434SQ201410367053
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】孫英麗, 于慧 申請人:中國科學院北京基因組研究所