一種快速檢測鹿粘膜病病毒bvdv的方法
【專利摘要】本發明提供了一種快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，通過將LDR與PCR技術相結合的檢測導致梅花鹿粘膜病的BVDV，具體為：首先，從NCBI中下載BVDV全序列，通過軟件比對BVDV的5’-UTR進行病毒特異性序列的設計，并以副豬嗜血桿菌的引物為通用引物進行探針合成；探針包括上游探針和下游探針，上游探針從左到右依次是上游通用引物對應序列、上游病毒特異序列，下游探針從左到右依次是下游病毒特異序列、下游通用引物對應序列。以病毒基因組RNA反轉錄的cDNA為模板進行LDR、PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。此方法的建立對鹿粘膜病病毒的流行病學調查和疫情控制具有重要的意義。
【專利說明】一種快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于畜牧獸醫學領域，尤其涉及一種快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法。

【背景技術】
[0002] 梅花鹿的粘膜病，是由牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一種以發熱、粘膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、免疫耐受與持續感染、 免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、懷孕母牛流產、產死胎或畸形胎為主要特征的一種接觸性傳 染病。許多方法被用于檢測BVDV。早期檢測BVDV的常規方法包括病毒分離鑒定、免疫熒光 技術、酶聯免疫吸附方法等，但這些方法費時、費力，實驗條件要求較高，靈敏度和特異性不 高。近來，PCR、LAMP等分子生物學方法被廣泛用于BVDV檢測，但這些方法亦存在假陽性問 題。連接酶檢測反應（LDR)其反應原理類似聚合酶鏈反應（PCR)，而反應特異性高于PCR。 當探針與目的DNA互補配對后，連接酶能通過催化磷酸二酯鍵將相鄰的兩條探針連接，當 探針的接頭處存在堿基錯配時，連接反應便不能進行。LDR技術具有特異性高、通用性好、適 用范圍廣等特點，通過整合入其它生物技術，在生物分子檢測中取得了更大的進展。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，旨在解決對地 區內梅花鹿粘膜病病毒流行病學調查以及凈化鹿場和快速對診斷梅花鹿粘膜病進行快速 診斷。
[0004] 本發明是這樣實現的，一種快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，包括以下步驟：
[0005] (1)探針的設計
[0006] 根據BVDV的5' -UTR設計病毒特異性序列，以副豬嗜血桿菌的引物為通用引物序 列，得到探針，所述探針包括：
[0007] 上游探針序列（5' -3'）：
[0008] TTACCGGCGAGAAGAGTTGGGCATAGCGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ；
[0009] 下游探針序列（5' -3'）：
[0010] TAACCTGGACGGGGGTCGCCTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT ；
[0011] ⑵BVDV的檢測
[0012] 通過上述上、下游探針以病毒基因組RNA反轉錄的cDNA模板進行LDR反應，得到 連接產物；
[0013] 通過上述通用引物序列以所述連接產物為模板進行PCR反應，得到擴增產物，瓊 脂糖凝膠電泳檢測電泳產物確定BVDV。
[0014] 優選地，在步驟（1)中，所述通用引物序列包括：
[0015] 上游通用引物序列（5' -3'）：
[0016] AATGGCCGCTCTTCTCAACCCGTATC ；
[0017] 下游通用引物序列（5' -3'）：
[0018] CTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT。
[0019] 優選地，在步驟（1)中，所述病毒特異性序列包括：
[0020] 上游病毒特異序列（5' -3'）：
[0021] CGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ；
[0022] 下游病毒特異序列（5' -3'）：
[0023] TAACCTGGACGGGGGTCGCC。
[0024] 優選地，在步驟⑵中，所述LDR反應具體為：以BVDV的cDNA為模板，進行LDR 連接反應，并對LDR反應體系和反應參數進行優化，優化后的反應體系為：50 μ Μ上、下游 探針各 1. 0 μ 1，2U Taq DNA 連接酶（40U/ μ 1)，約 20ng/ μ 1 cDNAl. 0 μ 1，10 X LDR Buffer 1· 0μ 1，ddH20 補齊至 10μ 1。反應條件：94°C預變性 3min，94°C變性 30s，68. 4°C 4min，10 個循環。
[0025] 優選地，在步驟⑵中，所述PCR反應具體為：以連接產物為模板，總體積25 μ 1的 PCR反應體系包括lOXBuffer 2.5yl，25mM MgCl22.0yl，上游通用引物（10μΜ)和下游 通用引物（1〇μΜ)各 0· 5μ 1，2· 5mM dNTP2. Ομ l，Taq DNA 聚合酶（5υ/μ 1)0. 25μ 1，LDR 連 接產物 1· Ομ 1。反應條件：94°C 3min，94°C 30s，53°C 30s，72°C 30s，72°C 5min，35 個循環。 反應結束后，2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
[0026] 本發明克服現有技術的不足，提供一種快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，通過 將LDR與PCR技術相結合的檢測導致梅花鹿粘膜病的BVDV，具體為：首先，從NCBI中下載 BVDV全序列，通過軟件比對BVDV的5 ' -UTR進行病毒特異性序列的設計，并以副豬嗜血桿菌 的引物為通用引物進行探針合成；探針包括上游探針和下游探針，上游探針從左到右依次 是上游通用引物對應序列、上游病毒特異序列，下游探針從左到右依次是下游病毒特異序 列、下游通用引物對應序列。以病毒基因組RNA反轉錄的cDNA為模板進行LDR、PCR擴增， 瓊脂糖凝膠電泳檢測。此方法的建立對鹿粘膜病病毒的流行病學調查和疫情控制具有重要 的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是本發明實施例中LDR退火溫度優化后的電泳檢測結果圖；其中，M :2000bp Marker，泳道1?5 :退火溫度依次為陰性對照，67. 2°C，68. 4°C，69. 6°C，70. 8°C ;
[0028] 圖2是本發明實施例中PCR退火溫度優化后的電泳檢測結果圖；其中，M :2000bp Marker，泳道1?6 :退火溫度依次為50°C，52°C，54°C，56°C，58°C，陰性對照；
[0029] 圖3是本發明實施例中LDR探針濃度和PCR引物濃度優化后的電泳檢測結果圖； 其中，M:DNA Marker DL2000;1:引物濃度ΙΟμΜ、探針濃度ΙΟμΜ時LDR-PCR結果；2:弓丨 物濃度1〇μΜ、探針濃度20μΜ時LDR-PCR結果；3 :引物濃度ΙΟμΜ、探針濃度50μΜ時 LDR-PCR結果；4:引物濃度20μΜ、探針濃度ΙΟμΜ時LDR-PCR結果；5 :引物濃度20μΜ、 探針濃度20 μ Μ時LDR-PCR結果；6 :引物濃度20 μ Μ、探針濃度50 μ Μ時LDR-PCR結果；7 : 引物濃度50μΜ、探針濃度ΙΟμΜ時LDR-PCR結果；8 :引物濃度50μΜ、探針濃度20μΜ時 LDR-PCR結果；9 :引物濃度50 μ Μ、探針濃度50 μ Μ時LDR-PCR結果；
[0030] 圖4本發明實施例中LDR-PCR檢測靈敏度結構圖；其中，M :2000bp Marker，泳道 2?6模板濃度依次為104, 103, 102, 101，10°拷貝和陰性對照。

【具體實施方式】
[0031] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0032] 牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)病毒株已在 文獻："董航，吉林大學，碩士論文《梅花鹿粘膜病滅活疫苗的制備與免疫效果檢測》"中公 開。
[0033] 主要儀器和試劑：凝膠電泳圖像分析系統（SynGen，英國）；PCR儀（Bio-Rad,美 國）；超微量核酸分光光度計（Thermo,美國），Taq DNA聚合酶、pUCm-T載體購自上海生工； Taq DNA連接酶購自NEB公司；其他試劑均為國產分析純。
[0034] 實施例1探針及引物設計
[0035] 根據GenBank中已發表的序列（具體序列登記號：JX276542. 1/GU120246. 1/ AB359932. 1/KC695810. 1/JN248734. 1/AJ304385. 1/LM994627. U JN715040. UAY363064. U KJ131535. 1、JN715018. 1、KC757383. 1、JQ994208. 1、JN967742. 1、EU224231. 1、U97455. 1、 AY363072. 1、⑶120248. 1、KF834226. 1、FJ615536. 1、FM165317. 1、DQ088995. 2、L20925. 1、 EF210349. 1、M31182. 1、FJ615532. 1、GQ495685. 1、AF417975. 1C)，應用 Primer Premier5.0 軟件設計引物和LDR探針，設計好的引物和探針通過NCBI中的BLAST進行特異性鑒定，如 表1和表2所示。探針引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0036] 表1通用引物序列
[0037]

【權利要求】
1. 一種快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 探針的設計 根據BVDV的5' -UTR設計病毒特異性序列，以副豬嗜血桿菌的引物為通用引物序列，得 到探針，所述探針包括： 上游探針序列（5' -3'）： TTACCGGCGAGAAGAGTTGGGCATAGCGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ； 下游探針序列（5' -3'）： TAACCTGGACGGGGGTCGCCTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT ； (2) BVDV的檢測 通過上述上、下游探針以病毒基因組RNA反轉錄的cDNA模板進行LDR反應，得到連接 產物； 通過上述通用引物序列以所述連接產物為模板進行PCR反應，得到擴增產物，瓊脂糖 凝膠電泳檢測電泳產物確定BVDV。
2. 如權利要求1所述的快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步驟（1) 中，所述通用引物序列包括： 上游通用引物序列（5' -3'）： AATGGCCGCTCTTCTCAACCCGTATC ； 下游通用引物序列（5' -3'）： CTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT。
3. 如權利要求2所述的快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步驟（1) 中，所述病毒特異性序列包括： 上游病毒特異序列（5' _3'）： CGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ； 下游病毒特異序列（5' _3'）： TAACCTGGACGGGGGTCGCC。
4. 如權利要求3所述的快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步驟（2) 中，所述LDR反應具體為：以BVDV的cDNA為模板，進行LDR連接反應，并對LDR反應體系和 反應參數進行優化，優化后的反應體系為：50μΜ上、下游探針各1.0yl，2U Taq DNA連接 酶（4〇υ/μ 1)，約 20ng/y 1 cDNAl. Ομ 1，10XLDR Bufferl. Ομ l，ddH20 補齊至 10μ 1，反應 條件：94°C預變性 3min，94°C變性 30s，68. 4°C 4min，10 個循環。
5. 如權利要求4所述的快速檢測鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步驟 (2)中，所述PCR反應具體為：以連接產物為模板，總體積25μ1的PCR反應體系包括 lOXBuffer 2· 5μ l，25mM MgCl22. 0μ 1，上游通用引物（10μΜ)和下游通用引物（10μΜ)各 0· 5μ 1，2· 5mM dNTP2. 0μ 1，Taq DNA 聚合酶（5υ/μ 1)0. 25μ 1，LDR 連接產物 1. 0μ 1，反應 條件：941：31^11，941：3〇8,531：3〇8,721：3〇8,721：51^11，35個循環，反應結束后，2%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
【文檔編號】C12Q1/70GK104195267SQ201410456381
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月9日 優先權日:2014年9月9日
【發明者】丁壯, 尹仁福, 叢彥龍, 穆昱, 周玉龍 申請人:吉林大學