利用rt-lamp快速檢測甘蔗花葉病毒的方法
【專利摘要】一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，包括如下步驟：根據NCBI上提供的甘蔗花葉病毒的序列設計4條LAMP特異引物F3、B3、FIP、BIP，樣品提取RNA反轉錄成cDNA之后進行RT-LAMP反應，通過對反應體系的設計和優化，在一個恒溫水浴鍋反應1h可以完成擴增，擴增產物可以通過電泳或者熒光染料實現檢測，是一種操作簡單、快速、靈敏而經濟的檢測方法。
【專利說明】利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，具體是一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法。
技術背景
[0002]甘鹿花葉病毒(Sorghum mosaic virus)是甘鹿的一種主要病毒病,屬于馬鈴薯Y病毒屬的甘蔗花葉病毒亞組成員。甘蔗花葉病的癥狀主要表現在葉片上。但染病蔗株可使整叢發病，病毒遍及全株。主要是葉綠素受到破壞或不正常發展而使葉部產生許多與葉脈平行的縱短條紋。其長短不一，有的淺黃色、有的淺綠色，與正常部分參差間隔成“花葉”。尤以新葉癥狀最為明顯。染病蔗株矮化，分蘗減少；宿根病蔗則發芽緩慢、生長不良。本病造成的損失主要是蔗種感病后，萌芽率低；病株生長差，汁液量減少。
[0003]環介導恒溫核酸擴增技術(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是由Notomi T等在2000年發明的，是一種基于高靈敏鏈置換技術的恒溫核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件^1_65°C左右)下保溫幾十分鐘，即可實現核酸的擴增。反應結果可通過反應副產物焦磷酸鎂白色沉淀的形成進行肉眼觀察，或者通過濁度儀檢測焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度來判定，也可在反應管中加入熒光染色試劑目測判定，無需特殊的儀器PCR儀，具有特異性強、靈敏度高等優點，是一種快捷而有效的檢測方法。目前已廣泛的應用于人類和動植物各種病毒、細菌、真菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷。
[0004]目前鑒定植物病毒常用的方法有:生物學接種實驗，血清學檢測，電鏡觀察及分子生物學檢測。其中分子生物學方法以PCR最為常見，但是PCR費時且需要昂貴的儀器PCR儀；而血清學檢測方法中，較為常見的有ELISA及DIBA等，但是靈敏度不夠高，特異性易受到限制。目前尚未見到使用LAMP方法檢測甘蔗花葉病毒的方法。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，能夠靈敏、特異的檢測出甘蔗花葉病毒。
[0006]為解決上述問題，本發明采用的技術方案是:一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，包括如下步驟:
[0007]I)根據NCBI已報道的甘蔗花葉病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通過多序列比對選擇相對保守序列，通過在線LAMP引物設計軟件primerExplorer V4設計4條引物,其中包括2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP ；
[0008]2)利用RNAiso Plus法提取甘蔗植株的總RNA ；
[0009]3 )利用M-MLV反轉錄酶把提取的RNA轉化為cDNA ；
[0010]4)設置不同的Mg2+濃度、dNTPs的濃度以及甜菜堿的濃度，確定最佳反應體系；分別改變反應的溫度進行RT-LAMP擴增反應，RT-LAMP反應溫度為63°C，反應時間為60_80min ；
[0011]5) RT-LAMP反應體系為:外引物F3和B3各0.25 μ M，內引物FIP和BIP各
1.5 μ M，Bst DNA 聚合酶(8U) I μ L, IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜堿 2 μ L，25mM MgS041 μ L,dNTPl.4mM，模版2μ L，DEPC處理的滅菌水加至25 μ L，63°C條件下反應時間為60min，80°C滅活5min ;以未感染樣品作為陰性對照驗證這一方法的特異性；
[0012]6)實驗結果通過肉眼判斷和利用1.5%的電泳檢測進行驗證或者熒光染料檢測可以檢測出甘蔗花葉病毒。
[0013]所述2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP的序列為:
[0014]F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
[0015]B3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
[0016]FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTA
[0017]TTGAAAACG-3
[0018]BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTT
[0019]CGC-3。
[0020]本發明的突出優點在 于:
[0021]利用LAMP方法既保證了檢測的靈敏性和特異性，同時又簡化了操作，并且也節省了成本，為甘蔗花葉病毒的檢測提供了一種靈敏、特異、經濟且簡單的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為不同溫度條件下RT-LAMP結果的電泳圖(M:標準分子量；1、61°C ;2、62°C ；
3、63°C ;4、64°C ;5、65°C ；6 陰性對照)。；
[0023]圖2為電泳檢測甘蔗花葉病毒的結果(Μ:標準分子量；1、甘蔗花葉病毒；2、陰性對照)【具體實施方式】
[0024]實施例1
[0025]本發明所述的利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，包括如下步驟:
[0026]甘蔗花葉病毒RT-LAMP反應條件的優化
[0027]1、引物的設計:
[0028]F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
[0029]Β3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
[0030]FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTATTGAA
[0031]AACG-3
[0032]BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTTCGC-3
[0033]甘蔗花葉病毒RT-LAMP的溫度梯度實驗
[0034]RT-LAMP反應體系為:外引物F3和Β3各0.25 μ Μ,內引物FIP和BIP各1.5 μ M，BstDNA聚合酶(8U)1 μ L, IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜堿2 μ L，25mM MgS041 μ L, dNTPl.4mM，模版2μ L，DEPC處理的滅菌水加至25 μ L。混勻反應物在61°C，62 °C, 63 °C，64°C，65°C五種條件下恒溫反應lh，80°C反應5min終止RT-LAMP反應，實驗結束之后取10 μ L擴增產物上樣，在1.5%的瓊脂糖膠上進行電泳，結果顯示在61 °C、62°C，63°C恒溫反應條件下有階梯狀擴增條帶，但是63°C條帶很清晰，而64°C、65°C恒溫反應以及陰性對照無階梯狀擴增條帶，如圖1所示，因此，本發明采用的RT-LAMP的反應溫度為63°C。
[0035]實施例2
[0036]甘蔗花葉病毒RT-LAMP反應的特異性試驗
[0037]為了驗證RT-LAMP的特異性，選擇未感染甘蔗花葉病毒的材料作為對照，結果顯示陰性對照沒有出現階梯狀擴增條帶，而有甘蔗花葉病毒的樣本擴增出目的產物，如圖2所示，這表明該RT-LAMP反應的特異性`較好。
【權利要求】
1.利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)根據NCBI已報道的甘蔗花葉病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通過多序列比對選擇相對保守序列，通過在線LAMP引物設計軟件primerExplorer V4設計4條引物,其中包括2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP ； 2)利用RNAisoPlus法提取甘蔗植株的總RNA ； 3)利用M-MLV反轉錄酶把提取的RNA轉化為cDNA； 4)設置不同的Mg2+濃度、dNTPs的濃度以及甜菜堿的濃度，確定最佳反應體系；分別改變反應的溫度進行RT-LAMP擴增反應，RT-LAMP反應溫度為63°C，反應時間為60_80min ； 5)RT-LAMP反應體系為:外引物F3和B3各0.25 μ M,內引物FIP和BIP各1.5 μ M，BstDNA 聚合酶(8U) I μ L，IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜堿 2 μ L，25mM MgS041 μ L，dNTPl.4mM,模版2μ L，DEPC處理的滅菌水加至25μ L，63°C條件下反應時間為60min，80°C滅活5min ；以未感染樣品作為陰性對照驗證這一方法的特異性； 6)實驗結果通過肉眼判斷和利用1.5%的電泳檢測進行驗證或者熒光染料檢測可以檢測出甘蔗花葉病毒。
2.根據權利要求1所述的利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，其特征在于，所述2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP的序列為:
F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
B3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTA
TTGAAAACG-3
BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTT
CGC-3。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484569SQ201310438344
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】溫榮輝, 陳保善, 司慧娟, 呂榜麗, 周龍武, 徐正贏, 袁小寧, 唐瑤 申請人:廣西大學