一種核酸內(nèi)切酶Ⅷ活性測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種核酸內(nèi)切酶Ⅷ活性測(cè)定方法，所述方法包括：首先根據(jù)單鏈DNA模板合成一段引物，其中所述引物由兩部分構(gòu)成，5’端的正常引物部分和3’端的末端封閉引物部分，該兩部分之間以dUTP相連；將該合成引物與單鏈DNA模板退火形成復(fù)合物；隨后在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸內(nèi)切酶Ⅷ(EndoVIII)的作用下在引物的dUTP位置產(chǎn)生脫嘧啶位點(diǎn)；接著利用具有鏈置換活性的聚合酶合成雙鏈DNA，然后測(cè)定反應(yīng)體系中雙鏈DNA和單鏈DNA的相對(duì)量，并根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果推導(dǎo)出核酸內(nèi)切酶Ⅷ活性程度，其中核酸內(nèi)切酶Ⅷ活性程度與反應(yīng)體系中雙鏈DNA的量成正相關(guān)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法無放射性污染，操作簡單便捷，可以對(duì)EndoⅧ活性進(jìn)行定量的檢測(cè)分析。
【專利說明】一種核酸內(nèi)切酶WI活性測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌Endo VDI (Endonuclease VIII，Endo VIII)由大腸桿菌nei 基因編碼。 EndoVIII既有N-糖基化酶活性也有AP-裂解酶活性。N-糖基化酶活性可釋放雙鏈DNA上 受損的嘧啶堿基，產(chǎn)生一個(gè)脫嘧啶（AP)位點(diǎn)。AP-裂解酶活性則分別在AP位點(diǎn)的3'和5' 端切割磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3'磷酸和5'磷酸末端。能被Endo VDI識(shí)別并切除的受損堿基包括： 尿素、5, 6-二羥基胸腺嘧啶、胸腺嘧啶乙二醇、5-羥基-5-甲內(nèi)酰脲、尿嘧啶乙二醇、6-羥 基-5, 6-二氫胸腺嘧啶和甲基羥丙二酰脲。
[0003] Endo VIII可應(yīng)用于單細(xì)胞凝膠電泳或稱彗星實(shí)驗(yàn)（(：〇11丨118，16七&1.(1993)· Carcinogenesis · 14，1733-1735.)。彗星實(shí)驗(yàn)是簡單、快捷檢測(cè)DNA微損傷的方法，被廣 泛應(yīng)用于遺傳毒理、放射生物學(xué)、生物監(jiān)測(cè)、癌癥化療和細(xì)胞凋亡、衰老等領(lǐng)域。是一個(gè)十分 成熟的技術(shù)，逐漸成為快速檢測(cè)DNA損傷的一種方法。
[0004] 此外，在分子生物學(xué)的某些領(lǐng)域中，Endo VIII具有獨(dú)特的作用。例如，NEB公司的 USER?酶，就是一種由尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG)和Endo VIII組成的混合酶。UDG識(shí)別 dUTP位點(diǎn)，將dU堿基切除，產(chǎn)生脫嘧啶（AP)位點(diǎn)。Endo VIII進(jìn)而在AP位點(diǎn)切割，從而將 核苷酸切除。這樣，只要在單鏈或雙鏈的特定位置引入dUTP位點(diǎn)，就可以用這兩種酶，將單 鏈切斷，或者在雙鏈上產(chǎn)生切口（Gap)。
[0005] 傳統(tǒng)的Endo VDI測(cè)活方法采用的是一種半定量的檢測(cè)方法。首先合成一條末端熒 光標(biāo)記的34mer的雙鏈寡核苷酸，其中一條鏈的中間有一個(gè)dUTP。用UDG將dU堿基切除 后，產(chǎn)生AP位點(diǎn)。再將Endo VDI做一系列的稀釋倍數(shù)進(jìn)行反應(yīng)，用變性膠電泳分離單鏈產(chǎn) 物。結(jié)果用電泳圖譜的分析存在相當(dāng)強(qiáng)的主觀性，缺乏定量指導(dǎo)，不能準(zhǔn)確測(cè)定切刻內(nèi)切酶 的活性，從而不能很好地保持批次之間的穩(wěn)定性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于建立一種簡便、快速、非放射性且定量的Endo VDI測(cè)活方法，其 原理如圖1所示。
[0007] 具體來說，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種核酸內(nèi)切酶W活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首先根據(jù)單鏈 DNA模板合成一段引物，其中所述引物由兩部分構(gòu)成，5'端的正常引物部分和3'端的末端 封閉引物部分，該兩部分之間以dUTP相連；將該合成引物與單鏈DNA模板退火形成復(fù)合物； 隨后在尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG)和核酸內(nèi)切酶VDI (EndoVIII)的作用下在引物的dUTP位 置產(chǎn)生脫嘧啶位點(diǎn)；接著利用具有鏈置換活性的聚合酶合成雙鏈DNA，然后測(cè)定反應(yīng)體系 中雙鏈DNA和單鏈DNA的相對(duì)量，并根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果推導(dǎo)出核酸內(nèi)切酶VDI活性程度，其中核 酸內(nèi)切酶VDI活性程度與反應(yīng)體系中雙鏈DNA的量成正相關(guān)。
[0008] 優(yōu)選地，雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是利用熒光染料，通過熒光法測(cè)得的，并且 雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。更優(yōu)選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA 特異性突光染料，例如可在市面上商購獲得的picogreen染料。
[0009] 優(yōu)選地，所采用的單鏈DNA模板是單鏈環(huán)狀DNA模板，聚合反應(yīng)所形成的雙鏈DNA 是在該單鏈環(huán)狀DNA模板上形成互補(bǔ)鏈而形成的雙鏈環(huán)狀DNA。更優(yōu)選，所采用的單鏈DNA 模板是M13噬菌體單鏈DNA，以利于建立標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法。
[0010] 作為建立標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例，所采用的具有鏈置換活性的聚合酶是大 腸桿菌DNA聚合酶I。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1. 無放射性污染； 2. 操作步驟簡單快速，重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)； 3. 可以對(duì)Endo VDI活性進(jìn)行定量的檢測(cè)分析，引物設(shè)計(jì)容易，便于操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明測(cè)定方法的原理圖。
[0013] 圖2是采用本發(fā)明方法獲得的酶活-熒光曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 本發(fā)明建立了一種簡便、快速、非放射性且定量的Endo VDI測(cè)活方法，其原理如圖1 所示。
[0015] 如圖1所示，合成中間有一個(gè)dUTP的末端封閉的引物，用該末端封閉引物和單鏈 模板如M13單鏈環(huán)狀DNA配制成模板/末端封閉引物復(fù)合物，如M13模板/末端封閉引物 復(fù)合物，當(dāng)用M)G (將dUTP去掉)和Endo VDI (斷裂磷酸二酯鍵)作用在M13模板/末端封閉 引物復(fù)合物上時(shí)，可產(chǎn)生一個(gè)AP位點(diǎn)，將末端封閉引物切成兩部分，形成一個(gè)前端與M13單 鏈環(huán)狀DNA匹配的正常引物和一個(gè)后端與M13單鏈環(huán)狀DNA不匹配的引物末端封閉引物， 大腸桿菌聚合酶I可以M13單鏈環(huán)狀DNA為模板，以正常引物為引物(加入U(xiǎn)DG和Endo VID 進(jìn)行聚合反應(yīng)。大腸桿菌聚合酶I的鏈置換活性可將后面的末端封閉引物引物替換下來， 繼續(xù)向3'端進(jìn)行延伸，生成M13雙鏈DNA。M13雙鏈DNA可被雙鏈特異性的picogreen染 料結(jié)合，產(chǎn)生熒光。而大腸桿菌聚合酶I不能在只有末端封閉引物存在時(shí)進(jìn)行聚合反應(yīng)，因 為引物的末端是封閉的，由此不能生成M13雙鏈DNA，picogreen染料不能結(jié)合單鏈DNA，從 而不能產(chǎn)生熒光。
[0016] 在UDG酶量固定的情況下，Endo VDI的活性在一定范圍內(nèi)同生成的正常引物的量成 正比；而在大腸桿菌DNA聚合酶I活性一定的情況下，正常引物的量同熒光強(qiáng)度成正比。因 此,本發(fā)明將Endo W的測(cè)活體系同大腸桿菌DNA聚合酶I的聚合反應(yīng)體系偶聯(lián)起來。
[0017] 本發(fā)明人進(jìn)一步證明了上述假設(shè)，從而建立了非放射性、簡便、快速且可以定量的 Endo VDI測(cè)活方法。
[0018] 下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0019] 實(shí)施例1.熒光法測(cè)定核酸內(nèi)切酶VIII的內(nèi)切酶活性 M13模板/末端封閉引物復(fù)合物的制備： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物M13末端封閉引物：5' -aagccatccgcaaaaaugacctct-3'（3'包括但不限于磷酸 化，氨基化，間隔子-C7,生物素化等修飾）； M13模板/末端封閉引物復(fù)合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13末端封閉引物按摩爾比 1:1混合，在退火緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩 慢降至室溫，使模板引物退火。
[0020] M13模板/正常引物復(fù)合物的制備： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物 M13 正常引物：5' -aagccatccgcaaaaa-3' M13模板/正常引物復(fù)合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13正常引物按摩爾比1: 1:1混 合，在退火緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩慢降 至室溫，使模板引物退火。
[0021] M13模板/正常引物/末端封閉引物-短復(fù)合物的制備： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物 M13 正常引物：5' -aagccatccgcaaaaa-3' 引物M13末端封閉引物-短：5' -gacctct-3'（3'包括但不限于磷酸化，氨基化，間隔 子-C7,生物素化等修飾）； M13模板/正常引物/末端封閉引物-短復(fù)合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13正常引 物、M13末端封閉引物-短按摩爾比1:1:1混合，在退火緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0， 50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩慢降至室溫，使模板引物退火。
[0022] 切刻反應(yīng)： UDG 為 NEB M0280L ; Endo VDI為NEB 0299L，活性定義為在10 μ 1緩沖液體系中，37°C條件下，1小時(shí)內(nèi)能夠 切割I(lǐng) pmol含一個(gè)AP位點(diǎn)*的34 mer寡核苷酸雙鏈所需要的酶量為1U。
[0023] UDG 反應(yīng)

【權(quán)利要求】
1. 一種核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首先根據(jù) 單鏈DNA模板合成一段引物，其中所述引物由兩部分構(gòu)成，5'端的正常引物部分和3'端的 末端封閉引物部分，該兩部分之間以dUTP相連；將該合成引物與單鏈DNA模板退火形成復(fù) 合物；隨后在尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG)和核酸內(nèi)切酶VDI (EndoVIII)的作用下在引物的 dUTP位置產(chǎn)生脫嘧啶位點(diǎn)；接著利用具有鏈置換活性的聚合酶合成雙鏈DNA，然后測(cè)定反 應(yīng)體系中雙鏈DNA和單鏈DNA的相對(duì)量，并根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果推導(dǎo)出核酸內(nèi)切酶VDI活性程度， 其中核酸內(nèi)切酶W活性程度與反應(yīng)體系中雙鏈DNA的量成正相關(guān)。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法，其特征在于，雙鏈DNA或單鏈DNA 的相對(duì)量是利用熒光染料，通過熒光法測(cè)得的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒光 強(qiáng)度表不的。
3. 如權(quán)利要求2所述的核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的熒光染料 是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權(quán)利要求3所述的核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的染料是 picogreen 染料。
5.如權(quán)利要求1所述的核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的單鏈DNA 模板是單鏈環(huán)狀DNA模板，聚合反應(yīng)所形成的雙鏈DNA是在該單鏈環(huán)狀DNA模板上形成互 補(bǔ)鏈而形成的雙鏈環(huán)狀DNA。
6.如權(quán)利要求5所述的核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的單鏈DNA 模板是Ml3噬菌體單鏈DNA。
7.如權(quán)利要求1所述的核酸內(nèi)切酶VDI活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的具有鏈置 換活性的聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I。
【文檔編號(hào)】C12Q1/34GK104313133SQ201410502172
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】曹林, 徐曉昱, 王靜 申請(qǐng)人:南京諾唯贊生物科技有限公司