一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提出了一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，該試劑盒包括：NE反應體系和熒光探針；或NE反應體系和熒光染料。所述的試劑盒還包括連續記錄熒光信號的儀器。本發明具有檢測更快速、定量和可進行微量分析；檢測時從原先的4h減少到30min，并且可以多樣品同時測定，和進行酶種類分析。
【專利說明】一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及核酸酶檢測【技術領域】，特別是指一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]非特異性核酸內切酶(Non-specific Endonuclease, NE)作用是把核糖核酸(包括DNA、RNA)降解成小的核酸片段和核苷酸，在生物制品行業中有廣泛的應用。尤其在醫藥用生物制品如病毒性疫苗和基因工程蛋白產品中，是降低宿主細胞核酸殘留的重要方法，而非特異性核酸內切酶本身的去除是高質量產品生產中的必須步驟，檢測其殘留也是產品質量評價中的重要一環。非特異性核酸內切酶(NE)屬于磷酸二酯酶系列，能水解核酸(包括DNA、RNA)中非特定位點的的3’ -5’磷酸二酯鍵，產物是3’核苷酸或寡核苷酸。常用的是來自于粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocalaureus)的非特異性核酸內切酶，以及核酸酶Pl (來自于桔青霉，Penicillium citrinum)等。非特異性核酸內切酶在工業中應用主要為1、(脫氧)核苷酸生產；2、生物制品中核酸殘留的去除；前者應用中核酸降解獲得的5’ 一核苷酸和5’ 一脫氧核苷酸可加工成各種醫用藥品、生化試劑、助鮮劑以及農作物促生長劑，它廣泛應用于生物工程、醫藥、食品、化妝品、農業生產和科研等領域，并具有很高的經濟價值。在生物制品中宿主細胞的核酸殘留控制是純化工藝的難點，尤其是病毒性疫苗抗原的生產中很難去除。采用非特異性核酸內切酶是去除殘留核酸的有效方法。
[0003]目前采用的方法為兩類:1、定性檢測方法，主要是通過在一定的反應體系中加入NE和鮭魚精DNA，反應在預定時間中止，設定陰性對照和陽性對照。然后用瓊脂糖電泳觀察DNA的片段分布，通常陽性樣本中根據酶活性不同，鮭魚精DNA會降解成在200bp~數kbp范圍的涂抹條帶，或約100~200bp大小的片段，或者基本降解后沒有可見條帶。該方法的優點是直觀、可靠，可以知道底物的水解程度，缺點是無法對酶活性進行定量分析；2定量檢測方法，典型的定量檢測方法，是通過在一定的反應體系中加入NE和鮭魚精DNA，反應在預定時間加酸(高氯酸)中止，設定陰性對照和陽性對照。然后高速離心(12000Xg)沉淀酸不可溶的DNA，以UV分析A26tlnm,通常IOD相當于I個單位。該方法是NE類酶活性定義的基本方法，其缺點是不能進行微量分析，必須事先知道所分析的酶種類。分析時間較長，通常為2~4h。

【發明內容】

[0004]鑒于以上現有技術中存在的問題，本發明提出一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，解決了現有技術中無法同時對酶活性進行定量和微量分析的技術問題。
[0005]本發明的技術方案是這樣實現的:
[0006]一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，該試劑盒包括:
[0007]NE反應體系和突光探針；[0008]或NE反應體系和熒光染料。[0009]作為優選的技術方案，所述的試劑盒還包括連續記錄熒光信號的儀器。
[0010]作為優選的技術方案，所述的試劑盒還包括定量PCR儀或熒光檢測儀。
[0011]作為優選的技術方案，所述的NE反應體系為通用反應緩沖液或系列反應緩沖液；所述的通用反應緩沖液是可同時應用于各酶的溶液，其成分包括Tris.Η(:1，濃度為IO-1OOmM,優選為20-50mM ;pH范圍為5~9.5，優選為5.4~8.5 ;還含有Ca2+、Zn2+或Mg2+，濃度為lmM-20mM，優選為2_10mM ;如果采用熒光染料，需事先加入DNA標準品，如鮭魚精DNA或合成的隨機引物，用量為l-500ng/y I ;所述系列反應緩沖液指分別針對單一酶設計的緩沖液組分，每組2-5種，其區別在于設計不同的pH值，使同一樣品在不同pH值下測定活性比，對照標準品獲得酶種類信息。
[0012]作為優選的技術方案，所述的突光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告突光基團和一個淬滅熒光基團；探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；NE反應時，酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每切開一個探針鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與酶作用產物形成同步。
[0013]作為更優選的技術方案，所述的熒光探針為長度10_30bp的寡聚核苷酸序列，5’末端標記發色基團，包括但不限于FAM、TET、HEX、TAMRA, ROX、CY5、CY3、JOE，3’末端標記淬滅基團，包括但不限于BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、DABCYL ;探針的使用量為每反應I μ M~20 μ Μ,優選為 2 μ M ~10 μ Mo
[0014]作為優選的技術方案，所述的熒光染料是指能特異性地摻入DNA雙鏈，在激發光下發射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發射任何熒光信號的物質，當NE把DNA雙鏈降解后，發射的熒光信號減弱，以此測定核酸的水解速度。
[0015]作為更優選的技術方案，所述的突光染料包括但不限于pico green、SYBR系列突光染料，其在NE反應體系中應用濃度為lng-100ng/100ul (0.1~10X)。
[0016]檢測步驟
[0017]取反應緩沖液,加入熒光探針或熒光染料,放置冰上，3-5min后,加入酶樣品；同時設置陽性對照和空白對照；放入熒光檢測儀器，事先設定儀器溫度為25°C或37°C，啟動記錄程序，記錄20-30min內熒光信號變化。
[0018]計算方法
[0019]以熒光檢測數據為Y軸，時間為X軸，獲得曲線方程，并計算酶反應曲線初速度。以系列稀釋標準品的酶反應曲線初速度制作標準曲線。測定樣品的酶反應曲線初速度和標準曲線對照，獲得酶活性單位數值。
[0020]本發明是基于核酸的熒光顯色原理，能進行微量和定量分析，可多樣本同時分析，并且本發明所包括的綜合酶反應體系能使所有已知NE能呈現高活性，因而對未知樣本的核酸酶活性進行檢測和評估，并且在系列緩沖液體系中所表現的酶活性特征可以對其種類進行初步判定。
[0021]有益效果
[0022](I)本發明具有檢測更快速、定量和可進行微量分析；
[0023](2)檢測時從原先的4h減少到30min，并且可以多樣品同時測定，和進行酶種類分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0025]圖1為本發明一種NE檢測原理圖(熒光探針);
[0026]圖2為本發明實施例中的金黃色葡萄球菌核酸酶反應曲線。
【具體實施方式】
[0027]下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0028]實施例1
[0029]1.熒光探針設計實例
[0030]在生物技術公司合成長度為20bp探針，5’末端為FAM標記，3’末端為BHQ-1標記，序列為 5’ -FAM-actgaggcacctgcctcagt-BHQ-1-3’。
[0031]2.檢測方法和步驟實例
[0032]A) Benzonase的標準品梯度制備原酶濃度為250U/ μ L，反應前取6 μ I按5倍稀釋(加水 24 μ I 并充分混勻)為 50U，依次稀釋至 20.00、15.00、10.00,5.00,2.50、1.00,OU/μ I,以備用。
[0033]B)反應體系如下:
[0034]標準品反應體系
【權利要求】
1.一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: NE反應體系和熒光探針； 或NE反應體系和熒光染料。
2.根據權利要求1所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括連續記錄熒光信號的儀器。
3.根據權利要求1所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括定量PCR儀或熒光檢測儀。
4.根據權利要求1所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的NE反應體系為通用反應緩沖液或系列反應緩沖液；所述的通用反應緩沖液其成分包括Tris.HCl，濃度為lO-lOOmM，pH范圍為5~9.5，還含有濃度為lmM-20mM的Ca2+、Zn2+或Mg2+ ;所述系列反應緩沖液指分別針對單一酶設計的緩沖液組分，每組2-5種，其區別在于設計不同的PH值，使同一樣品在不同pH值下測定活性比，對照標準品獲得酶種類信息；所述的突光探針為一寡聚核苷酸，兩端分別標記一個報告突光基團和一個淬滅突光基團；探針完整時，報告熒光基團發射的熒光信號被淬滅熒光基團吸收；所述的熒光染料是指能特異性地摻入DNA雙鏈，在激發光下發射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發射任何熒光信號的物質，當NE把DNA雙鏈降解后，發射的熒光信號減弱。
5.根據權利要求4所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的通用反應緩沖液其成分包括Tris.HC1，濃度為20-50mM，pH范圍為5.4~8.5，還含有濃度為2mM-10mM的 Ca2+、Zn2+或Mg2+。
6.根據權利要求4所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述NE反應體系和熒光染料中，NE反應體系需事先加入DNA標準品，用量為l_500ng/μ I。
7.根據權利要求4所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的熒光探針為長度10_30bp的寡聚核苷酸序列，5’末端標記發色基團，包括但不限于FAM、TET、HEX、TAMRA, ROX、CY5、CY3、J0E，3’末端標記淬滅基團，包括但不限于BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、DABCYL ;探針的使用量為每反應I μ M~20 μ M。
8.根據權利要求7所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的熒光探針的使用量為每反應2μ M~10 μ Μ。
9.根據權利要求4所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，所述的熒光染料包括但不限于Pico green、SYBR系列熒光染料，熒光染料在NE反應體系中應用濃度為lng-100ng/100ul (0.1~10X)。
10.根據權利要求1-9任一權利要求所述的一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，其特征在于，檢測步驟如下:取反應緩沖液，加入熒光探針或熒光染料，放置冰上，3-5min后，加入酶樣品；同時設置陽性對照和空白對照；放入熒光檢測儀器，事先設定儀器溫度為25°C或37°C，啟動記錄程序，記錄20-30min內熒光信號變化。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540650SQ201210238082
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月11日 優先權日:2012年7月11日
【發明者】阮承邁, 孫衛華, 王志剛 申請人:北京合康源生物科技有限公司