專利名稱：金黃色葡萄球菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于致病微生物檢測技術領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測試劑盒。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬Staphylococcus)，是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，因此食品受其污染的機會很多。近年來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國每年發生的此類中毒事件也非常多。因此，建立一種有效的金黃色葡萄球菌檢測技術對于食品安全檢測具有重要的作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種金黃色葡萄球菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，以克服現有技術的不足，從而為食品安全提供科學的依據和指導作用。本發明的主要原理如下(1)設計一對5'端帶切刻內切酶識別序列的引物和一對分別由生物素和FITC標記的探針；(2)把引物和目標菌的模板DNA加入到模板預處理反應液，在Taq PlatinumDNA聚合酶作用下，通過幾個預變性和擴增的循環過程，把切刻內切酶識別序列引入到待擴增序列中，作為NEMA恒溫擴增的模板；(3)切刻內切酶識別NEMA模板上的識別序列，在其中一條核酸鏈上切割形成切
口，暴露其3'端；(4)在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3'端為起點，以未被切斷的另一條核酸鏈為模板，合成新的雙鏈核酸，舊鏈被剝離下來成為下一輪核酸合成的模板，同時在新合成的雙鏈核酸上恢復切刻內切酶識別位點；(5)切割、延伸和剝離的步驟重復進行，擴增出大量靶核酸序列；(6)擴增產物利用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測；核酸擴增完成后，在反應管中加入探針與擴增產物雜交。把檢測板水平放置在操作臺上，取雜交產物 ο μ L加入檢測板的樣品孔中，再加入100 μ L緩沖液進行層析，IOmin
左右判讀結果。通用型核酸擴增物快速檢測板(杭州優思達生物技術有限公司批號20101(^6-2)的上C為質控區，T為檢測區。檢測板在質控區C和檢測區T均出現紅色條帶，為陽性結果， 表明樣本中含有檢測的目標物；僅在質控區C出現紅色條帶，為陰性結果，表明樣本中為檢出目標物；質控區C和檢測區T內均無紅色條帶出現，表明快速檢測板失效。本發明的一個方面涉及用于恒溫擴增快速檢測金黃色葡萄球菌的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID NO 1 5-CCTGAAAATAAAAAGCTCTTCAACAAGCGAGATAACTTACAAC-3 ；反向引物序列為SEQ ID NO 2 5-AAACTACTTCATAGCTCTTCATAAAGAAGAAACCAGCAGAG-3 ；Pl探針的序列為SEQ ID NO 3 P1 5-GCGAGATAACTTACAACAACAACTTG-3 5 端標記生物素；P2探針的序列為SEQ ID NO 4 P2 5-TTACCTATCTCTGCTGGTTTCTTCTT-3 3 端標記 FITC。本發明的另一個方面涉及一種金黃色葡萄球菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下的組分(1)模板預處理反應液每 23μ L 包括 IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液,0· 1 1. Ommol/ L dNTP，0. 1 l.Oymol/L 正向引物，0. 1 l.Oymol/L 反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase2. 5U ；所述的IOXiTaq Platinum buffer II 反應緩沖液成分為200mM Tris-HCl ρΗ8· 8，IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgCl2 ；(2) NEMA恒溫擴增反應液每46 μ L 包括 IOXNEBuffer 3 反應緩沖液，0. 1 1. Ommol/L dNTP，5% 30% DMS0，0. 1 1. Oymol/L正向引物，0. 1 1. 0 μ mol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白 (BSA)；其中所述的10 X NEBuffer 3 反應緩沖液成分為IOOmmol/L NaCl，50mmol/ LTris-HCl, 10mmol/L MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9;(3) Nt. BspQI 切刻內切酶:4U/y L ；(4) Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；(5)5'端標記生物素探針Pl和3'端標記FITC的探針P2各10 μ mol/L(6)通用型核酸擴增物快速檢測板。型號3號。上述試劑盒應用于檢測食品中的金黃色葡萄球菌，其使用方法，依次包括下列步驟(1H4)(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6-2. 0范圍內，濃度在 IO-IOOng/μ L 范圍內；(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴 7min后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板；
(3) NEMA恒溫擴增反應在裝有46 μ L NEMA擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA，LOyL Nt. BspQI切刻內切酶和1. 0 μ L Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min，反應結束后取出；⑷產物檢測反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5μ ，90τ水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。檢測線T和質控線C均顯示紅色，說明待檢樣品為陽性。本發明的試劑盒根據待檢菌株的保守基因序列設計5'端帶切刻內切酶識別序列的引物，保證檢測方法的特異性。本發明采用改進的切刻內切酶核酸恒溫擴增(NEMA)技術，該技術特異性強，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測即可，簡單、快速、安全、無污染，特別適用于食品檢測機構。
具體實施例方式下面結合實例對本發明的方法做進一步說明，但實例僅限于說明，并不限于此， 其中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ帡l件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。實施例1對金黃色葡萄球菌標準菌株的檢測按下列配方制作金黃色葡萄球菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增檢測試劑盒1)模板預處理反應液每 23yL 含有 2.5yL IOXTaq Platinum buffer II, l.OyL 2. 5mmol/L dNTP, l.OyL 10ymol/L 正向引物，l.OyL 10 μ mol/L 反向引物，1. 0 μ L 2. 5U/ μ LTaq Platinum DNA Ploymerase 禾口 16. 5 μ L ddH20(滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO 1 5' -TCCTGAAAATAAAAAGCTCTTCAACAAGCGAGATAACTTACAAC-3'；反向引物SEQID NO :2 5' -TAAACTACTTCATAGCTCTTCATAAAGAAGAAACCAGCAGAG-3'；其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；
2) NEMA恒溫擴增反應液每46yL 含 W 5 μ L IOXNEBuffer 3, 1. 0 μ L 2. 5mmol/L dNTP, l.OyL 10μ mol/L 正向引物，l.OyL 10 μ mol/L 反向引物，0. 5 μ L 10mg/ml BSA,4y L DMSO 和 33. 5 μ LddH2O (滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO 1 5 ‘ -TCCTGAAAATAAAAAGCTCTTCAACAAGCGAGATAACTTACAAC-3‘；反向引物SEQID NO :2 5' -TAAACTACTTCATAGCTCTTCATAAAGAAGAAACCAGCAGAG-3'；其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；3) Nt. BspQI 切刻內切酶:4U/y L ；4) Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；
5)探針 Pl 禾口 P2 :10ymol/L ；其中所述的探針Pl的序列為SEQ ID NO 3Pl 5' -GCGAGATAACTTACAACAACAACTTG-3‘ 5'端標記生物素；探針P2的序列為SEQ ID NO 4 P2 5' -TTACCTATCTCTGCTGGTTTCTTCTT-3‘ 3'端標記 FITC。6)核酸薄層層析檢測板。型號3號；按照以下(1) - (4)程序進行檢測(1)待檢樣品(金黃色葡萄球菌ATCC 25923) DNA的提取提取待檢樣品金黃色葡萄球菌ATCC 25923核酸，其中提取的樣品DNA0D26(1/0D28(1 在1.6 2. 0范圍內，濃度在10 IOOng/ μ L范圍內。(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴 7min后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板。 (3)進行NEMA恒溫擴增反應將裝有46 μ LNEMA恒溫擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA， l.OyL Nt. BspQI切刻內切酶和l.OyL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。 反應結束后取出；(4)產物檢測反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5μ ，90τ水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。在質控區C和檢測區T均出現紅色條帶，說明待檢樣品為金黃色葡萄球菌。結果證明本發明的引物和探針可以有效的檢測出金黃色葡萄球菌，而不會產生假陰性結果。實施例2 對大腸埃希氏菌ATCC 25922的檢測1)模板預處理反應液每 23yL 含有 2.5yL IOXTaq Platinum buffer II, l.OyL 2. 5mmol/L dNTP, Ι.Ομ LlOy mol/L 正向引物，l.OyL 10 μ mol/L 反向引物，1· 0 μ L 2. 5U/ μ L Taq Platinum DNAPloymerase 禾Π 16. 5 μ L ddH20 (滅菌雙蒸水)。2) NEMA恒溫擴增反應液每46yL 含 W 5 μ L IOXNEBuffer 3, 1. 0 μ L 2. 5mmol/L dNTP, l.OyL 10μ mol/L 正向弓I物，1. OyL 10 μ mol/L 反向弓| 物，0· 5 μ L 10mg/mL BSA,4y L DMSO 禾口 33. 5 μ LddH2O (滅菌雙蒸水)。6)核酸薄層層析檢測板。型號3號；按照以下(1)- )程序進行檢測(1)待檢樣品(大腸埃希氏菌ATCC 25922) DNA的提取提取待檢樣品大腸埃希氏菌ATCC 25922核酸，其中提取的樣品DNA OD260/ OD28tl在 1. 6 2. 0范圍內，濃度在10 IOOng/μ L范圍內。將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴 7min后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板。(3)進行NEMA恒溫擴增反應將裝有46 μ LNEMA恒溫擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA， 1. 0 μ LNt. BspQI切刻內切酶和l.OyL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。 反應結束后取出；(4)產物檢測反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5μ ，90τ水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。質控區C顯示紅色條帶，檢測區T無紅色條帶出現，說明待檢樣品不是金黃色葡萄球菌。這個結果也證實了本發明的引物和檢測試劑盒在應用的時候不會產生假陽性。實施例3 對疑似感染金黃色葡萄球菌食品樣品的檢測將食品樣品按照實施例1描述的方法進行DNA的提取和擴增檢測，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。結果質控區C顯示紅色條帶，檢測區T也有紅色條帶出現，說明待檢樣品受到了金黃色葡萄球菌的感染。本發明的引物、探針和試劑盒還可以對其它的樣品進行金黃色葡萄球菌的檢測。
權利要求
1.一種切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測金黃色葡萄球菌的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID NO 1 ；反向引物序列為SEQ ID NO 2 ；Pl探針的序列為SEQ ID NO 3 P2探針的序列為SEQ ID NO :4。
2.如權利要求1所述的引物及探針，其特征在于所述的Pl探針的5'端標記生物素， P2探針的3'端標記FITC。
3.權利要求1所述的引物和探針用于檢測食品中的金黃色葡萄球菌。
4.一種金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒，包括如下的組分(1)模板預處理反應液其中包括 IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液、0. 1 1. Ommo 1/LdNTP，0. 1 1.(^11101/1正向引物，0.1 1.(^11101/1反向引物，丁89 PlatinumDNA Polymerase 2. 5U ；所述的 IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液成分為200mM Tris_HClpH8. 8， IOOmM KCl, IOOmM(NH4) 2S04,20mM MgCl2 ；(2)NEMA恒溫擴增反應液包括 10XNE Buffer 3 反應緩沖液，0. 1 1. Ommol/L dNTP，5% 30% DMS0,0. 1 1.(^11101/1正向引物，0. 1 l.Oymol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白；其中所述的IOXNEBuffer 3反應緩沖液成分為100mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9;(3)Nt. BspQI 切刻內切酶:4υ/μ L ；(4)Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；(5)5 ‘端生物素標記探針Pl和3 ‘端FITC標記探針Ρ2各10 μ mol/L(6)通用型核酸擴增物快速檢測板；其中正向引物、反向引物和探針P1、P2的序列如權利要求1所述。
5.權利要求4所述的試劑盒用于檢測食品中的金黃色葡萄球菌。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其使用方法包括如下的步驟(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA ODa5tZOD28tl在1. 6 2. 0范圍內，濃度在10 IOOng/μ L范圍內；(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴7min 后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板；(3)NEMA恒溫擴增反應在裝有46 μ L NEMA擴增反應液的反應管中加入2μ L預處理過的模板DNA，LOyL Nt. BspQI切刻內切酶和1. 0 μ L Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min，反應結束后取出；(4)產物檢測反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5 μ L，90°C水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。
全文摘要
本發明涉及一種用于恒溫擴增快速檢測金黃色葡萄球菌的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID NO1，反向引物序列為SEQ ID NO2；P1探針的序列為SEQ ID NO3P2探針的序列為SEQ ID NO4。同時本發明還提供一種包含上述引物探針序列的，用于恒溫擴增快速檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，以及應用方法。本發明的試劑盒根據待檢菌株的保守基因序列設計引物和探針，從而保證檢測方法的特異性。且具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可。結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測即可，簡單、快速、安全、無污染，特別適用于食品檢測機構。
文檔編號C12Q1/68GK102424836SQ201110366398
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者唐靜, 姜英輝, 尼秀媚, 李正義, 王妍婷, 王建廣, 趙麗青, 雷質文 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心