一種千年健懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發明研究了一種千年健懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌培養體系的建立、愈傷組織的誘導、增殖和懸浮細胞培養體系的建立等步驟，本發明方法所制備的千里健懸浮細胞分散性好，細胞團大小大致相同，生長迅速，重復性好，易于控制，為細胞大規模培養生產相關藥用物質打下基礎。
【專利說明】 一種千年健懸浮細胞的快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種千年健懸浮培養的快繁方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]千年健，天南星科,別名一包針、千顆針、千年見、絲棱線,多年生草本植物。根莖匍匐，肉質根圓柱形，花前席卷成紡錘形，盛花時上部略展開成短舟狀，子房長圓形，胚珠多，褐色種子長圓形。綠色的扇子葉，花期7?9月。千年健喜溫暖、濕潤、郁閉，怕寒冷、干旱和強光直射，是比較典型的喜陰植物。一般在年平均氣溫22°C左右、年降雨量1000毫米以上、空氣相對濕度80%以上、郁閉度在70% - 90%。土壤含水量在30%?40%的肥沃砂壤上生長良好。能耐(TC左右短時低溫。過于干旱，植株易枯萎死亡。在強光下植物生長緩慢，葉子變黃，甚至發生灼傷現象。千年健生長緩慢，在生長期間隨地上莖的增高，根莖也增長和增粗，并不斷從根莖節上抽出新芽，長出新的分株，形成植株叢。一年四季都可抽芽形成新的分株，營養生長期抽芽成株多，花期抽芽成株少。生于海拔80?IlOOm的溝谷密林下、筆林和山坡灌叢中。竹林和山坡灌叢中。藥用部位是千年健的干燥根莖。春、秋二季采挖，洗凈，除去外皮，曬干。氣香，味辛、微苦。性辛，溫，小毒。歸入肝；腎；胃經。具有祛風濕、舒筋活絡、止痛、消腫等功效。能治風濕痹痛、肢節酸育、筋骨痿軟、跌打損傷、胃痛、癰疽瘡腫等。繁殖方法主要采用根狀莖繁殖。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種千年健懸浮細胞的快速繁殖方法，由該方法所制備的千年健懸浮細胞分散性好，細胞團大小大致相同，生長迅速，重復性好，易于控制，為通過細胞大規模培養生產相關藥用物質打下基礎。
[0004]本發明所要解決的技術問題是通過以下方案來實現的:
取千年健幼嫩的葉片，洗衣粉溶液中浸泡30min，用刷子刷洗外植體表面，流水沖洗3h,在超凈工作臺上0.2%的次氯酸鈉處理20min，無菌水沖洗8次，吸水紙吸干，消毒處理過的千年健幼嫩的葉片切割成Icm2的小塊接入ΗΒ+ΙΑΑ0.1-0.2mg/L+6-BAl.0-1.5mg/L+l.0-1.5mg/L2, 4_D培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，半凝固劑為瓊脂6g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，弱光照，溫度24°C，取誘導出來的顏色淡黃，質地疏松的愈傷組織1.5g放入液體培養基改良HB+0.lmg/L2, 4-D+3.0mg/L6_BA+lg/L胡蘿卜汁進行液體懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，光照強度21001x，光照時間13h/d，溫度25°C，接入150ml三角瓶的液體培養基中震蕩培養，培養基25ml，轉速100r/min，兩周繼代一次，繼代時用80目篩過濾。
[0005]采用本發明制備的懸浮細胞增長率高，周期短，產量大，利于大規模種植。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。
【具體實施方式】
[0007]實施例1
取千年健幼嫩的葉片，洗衣粉溶液中浸泡30min，用刷子刷洗外植體表面，流水沖洗3h,在超凈工作臺上0.2%的次氯酸鈉處理20min，無菌水沖洗8次，吸水紙吸干，消毒處理過的千年健幼嫩的葉片切割成Icm2的小塊接入ΗΒ+ΙΑΑ0.lmg/L+6-BAl.0mg/L+1.0mg/L2, 4_D培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，半凝固劑為瓊脂6g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，弱光照，溫度24°C，取誘導出來的顏色淡黃，質地疏松的愈傷組織1.5g放入液體培養基改良HB+0.lmg/L2, 4-D+3.0mg/L6-BA+lg/L胡蘿卜汁進行液體懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，光照強度21001x，光照時間13h/d，溫度25°C，接入150ml三角瓶的液體培養基中震蕩培養，培養基25ml，轉速100r/min，兩周繼代一次，繼代時用80目篩過濾，增長率提高56%。
[0008]實施例2
取千年健幼嫩的葉片，洗衣粉溶液中浸泡30min，用刷子刷洗外植體表面，流水沖洗3h,在超凈工作臺上0.2%的次氯酸鈉處理20min，無菌水沖洗8次，吸水紙吸干，消毒處理過的千年健幼嫩的葉片切割成Icm2的小塊接入ΗΒ+ΙΑΑ0.2mg/L+6-BAl.5mg/L+l.5mg/L2, 4_D培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，半凝固劑為瓊脂6g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，弱光照，溫度24°C，取誘導出來的顏色淡黃，質地疏松的愈傷組織1.5g放入液體培養基改良HB+0.lmg/L2, 4-D+3.0mg/L6-BA+lg/L胡蘿卜汁進行液體懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，光照強度21001x，光照時間13h/d，溫度25°C，接入150ml三角瓶的液體培養基中震蕩培養，培養基25ml，轉速100r/min，兩周繼代一次，繼代時用80目篩過濾，增長率提高50%。
[0009]實施例3
取千年健幼嫩的葉片，洗衣粉溶液中浸泡30min，用刷子刷洗外植體表面，流水沖洗3h,在超凈工作臺上0.2%的次氯酸鈉處理20min，無菌水沖洗8次，吸水紙吸干，消毒處理過的千年健幼嫩的葉片切割成Icm2的小塊接入ΗΒ+ΙΑΑ0.2mg/L+6-BAl.5mg/L+l.0mg/L2, 4_D培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，半凝固劑為瓊脂6g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，弱光照，溫度24°C，取誘導出來的顏色淡黃，質地疏松的愈傷組織1.5g放入液體培養基改良HB+0.lmg/L2, 4-D+3.0mg/L6-BA+lg/L胡蘿卜汁進行液體懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，光照強度21001x，光照時間13h/d，溫度25°C，接入150ml三角瓶的液體培養基中震蕩培養，培養基25ml，轉速100r/min，兩周繼代一次，繼代時用80目篩過濾，增長率52%。
【權利要求】
1.一種千年健懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌培養體系的建立、愈傷組織的誘導、增殖和懸浮細胞培養體系的建立，其主要步驟如下: (1)取千年健幼嫩的葉片，進行消毒處理； (2)取步驟(I)消毒處理過的千年健幼嫩的葉片切割成Icm2的小塊接入HB+IAA0.1-0.2mg/L+6-BAl.0-1.5mg/L+l.0-1.5mg/L2, 4-D 培養基中進行愈傷組織誘導，附加鹿糖30g/L,半凝固劑為瓊脂6g/L, pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0,弱光照，溫度24 0C ； (3)取步驟(2)誘導出來的愈傷組織放入液體培養基改良HB+0.lmg/L2, 4-D+3.0mg/L6-BA+lg/L胡蘿卜汁進行液體懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH值以lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調至6.0，光照強度21001x，光照時間13h/d，溫度25°C。
2.按照權利要求1所述的一種千年健懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(I)中所述千年健無菌葉片的獲得為取千年健幼嫩的葉片，洗衣粉溶液中浸泡30min，用刷子刷洗外植體表面，流水沖洗3h，在超凈工作臺上0.2%的次氯酸鈉處理20min，無菌水沖洗8次，吸水紙吸干。
3.按照權利要求1所述的一種千年健懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(3)中千年健液體懸浮細胞培養的條件為取顏色淡黃，質地疏松的愈傷組織1.5g接入150ml三角瓶的液體培養基中震蕩培養，培養基25ml，轉速100r/min，兩周繼代一次，繼代時用80目篩過濾。
【文檔編號】C12N5/02GK104263696SQ201410540658
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】劉東鋒, 楊成東 申請人:南京帝道農業科技有限公司