專利名稱：一種無胃溫水性魚腸細胞懸浮培養方法
技術領域：
本發明涉及一種動物腸細胞分離和培養方法，具體涉及一種無胃溫水性魚腸細胞分離和懸浮培養方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
魚類腸細胞為腸道主要功能性細胞，參與腸道營養物質的消化吸收、免疫屏障和應激反應等多種重要生理過程。由于神經、體液和許多類群細胞與腸細胞間存在廣泛的相互作用，使體內試驗研究腸細胞非常困難。而腸細胞體外培養研究模型是探討營養物質對腸細胞營養作用機制、藥物、重金屬及其它有毒有害物質對腸道損傷與腸道修復機制、篩選有益魚類腸道健康的功能性物質的理想模型。因此，依據腸細胞的生物學特點，建立體外魚腸細胞培養研究模型，對于各相關領域的研究非常重要。細胞培養是指由活體組織，原代培養物、細胞系或細胞株經酶、機械力或化學的離散作用得到分散細胞，在體外適宜條件下，使細胞生長增殖，并保留其一定的結構和功能特性的技術。根據分散細胞的來源可分為原代培養和傳代培養，前者指從來源組織直接離散獲得細胞的首次培養，又叫初代培養；后者指從原代培養物、細胞系或細胞株離散的細胞， 經稀釋，接種到新培養器皿內的繼續擴大培養。原代培養細胞來源于新鮮動物組織。由于剛從活體組織上分離出來，具有二倍體遺傳性，其代謝和功能與活體更為接近，在一定程度上反映了體內的特性。因此，原代培養模型適合營養、藥物、細胞生長等研究，越來越受到重視。根據腸細胞生長培養特點，原代腸細胞培養可分為貼壁培養和懸浮培養。懸浮培養的特點是分離后的腸細胞接種后，懸浮在培養液中進行培養。但在無胃溫水性魚類上，至今仍無腸細胞懸浮培養技術。有胃冷水性魚類的腸道結構、生理特點與無胃溫水性魚類存在很大差異，因此現有的有胃冷水性魚腸細胞的分離方法、懸浮培養參數都無法直接應用于無胃溫水性魚類。在這種前提下，研究無胃溫水性魚類腸細胞懸浮培養方法，可為研究魚類腸細胞營養生理和代謝、營養物質消化吸收機制提供物質基礎和有效手段，意義重大。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種無胃溫水性魚腸細胞體外培養方法，使用該種方法能有效地實現無胃溫水性魚腸細胞的分離和懸浮培養。為了解決上述技術問題，本發明提供一種無胃溫水性魚腸細胞分離和懸浮培養方法，依次包括以下步驟1、選擇體重400-600g的健康鯉魚或草魚，用2%烏拉坦溶液浸泡麻醉，待魚體翻倒后，切去頭部，破壞脊髓。按常規方法將魚體表消毒，無菌取出整個內臟，去除腸道表面的系膜組織，用溶液-1 (Hanks液)洗凈腸道內容物。2、先將腸道一端扎住，用溶液-1充滿腸道，另一端用止血鉗夾住，在室溫下孵育 10分鐘。然后棄去溶液，以除去腸內可能殘余的食糜和黏液。
3、再用溶液-2 (Hanks液+0. 2mMEDTA)充滿腸道，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40 轉/分，振蕩孵育15分鐘。然后將腸腔內含有腸細胞的溶液收集起來。再用溶液-2充滿腸腔，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40轉/分，振蕩孵育15分鐘。4、將收集的腸細胞懸液混合在一起，在1500 Xg冷凍離心lOmin。5、收集的細胞沉淀用溶液-3(DMEM培養液+42U膠原蛋白酶I)重新懸浮，在25°C 振蕩孵化15min，腸細胞懸液經100-μ m孔徑血液尼龍網過濾，在1500Xg冷凍離心lOmin。 細胞沉淀重新懸浮在溶液-4 (DMEM培養液+0. 5 %胎牛血清)中，供試驗使用。6、細胞膜完整性用0. 5%臺盼藍染料排斥法檢測。細胞懸液和染料等體積混合，滴加在計數板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計數死細胞數和細胞總數，計算細胞活力。7、細胞懸液在1500Xg冷凍離心lOmin，分別測定上清液和細胞沉淀乳酸脫氫酶 (LDH)的活性。細胞沉淀的LDH活性反映細胞的代謝活力，上清液的LDH活性反映細胞膜的完整性。8、臺盼藍染色法確定細胞活力在90%以上，將細胞濃度調整為12X106cell/ml， 用于培養實驗。輕輕混勻細胞懸液，取試驗所需的細胞懸液數量，^rc振蕩培養，70轉/分， 培養總時間為MOmin。作為本發明的魚腸細胞體外培養方法的改進步驟3)腸細胞分離的適宜EDTA濃度和時間處理包括以下內容A、分離魚腸細胞的EDTA適宜濃度為0. 2mM,分離液與組織的適宜比例為1 10 ；B、分離的適宜溫度為20°C，振蕩轉速40轉/分，分離時間為15分鐘。作為本發明的魚腸細胞體外培養方法的改進步驟8)分離腸細胞的懸浮培養條件處理包括以下內容A、培養溫度以2546°C為宜。B、使用細胞培養器皿密閉培養。C、所用培養液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素。與現有技術相比，本發明1、本發明首次提出無胃溫水性魚腸細胞懸浮培養方法。2、本發明根據無胃溫水性魚腸道組織結構特點，摸索了最佳的魚腸細胞分離技術。3、本發明所述的培養條件和方法，能夠幫助初次進行細胞培養的研究人員，比較順利的完成魚腸細胞的分離和懸浮培養。


圖1分離良好的鯉魚腸細胞。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。1、選擇體重500g左右的健康鯉魚或草魚，用2%烏拉坦溶液浸泡麻醉，待魚體翻倒后，切去頭部，破壞脊髓。按常規方法將魚體表消毒，無菌取出整個內臟，去除腸道表面的系膜組織，用溶液-1 (Hanks液)洗凈腸道內容物。2、先將腸道一端扎住，用溶液-1充滿腸道，另一端用止血鉗夾住，在室溫下孵育 10分鐘。然后棄去溶液，以除去腸內可能殘余的食物顆粒和黏液。3、再用溶液-2 (Hanks液+0. 2mMEDTA)充滿腸道，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40 轉/分，振蕩孵育15分鐘。然后將腸腔內含有腸細胞的溶液收集起來。再用溶液-2充滿腸腔，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40轉/分，振蕩孵育15分鐘。分離鯉魚腸細胞的EDTA 適宜濃度為0.2mM，分離液(ml)與組織(g)的適宜比例為1 10(ml/g)；4、將收集的腸細胞懸液混合在一起，在1500 Xg冷凍離心lOmin。5、收集的細胞沉淀用溶液-3 (DMEM培養液+42U膠原蛋白酶I)重新懸浮，在25°C 振蕩孵化15min，腸細胞懸液經100- μ m孔徑血液尼龍網過濾，在1500 X g冷凍離心IOmi η。 細胞沉淀重新懸浮在溶液_4(DMEM培養液+0. 5%胎牛血清)中，供試驗使用。6、細胞膜完整性用0. 5%臺盼藍染料排斥法檢測。細胞懸液和染料等體積混合，滴加在計數板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計數死細胞數和細胞總數，計算細胞活力。7、細胞懸液在1500Xg冷凍離心lOmin，分別測定上清液和細胞沉淀乳酸脫氫酶 (LDH)的活性。細胞沉淀的LDH活性反映細胞的代謝活力，上清液的LDH活性反映細胞膜的完整性。8、臺盼藍染色法確定細胞活力在90%以上，將細胞濃度調整為12X106cell/ml， 用于培養實驗。輕輕混勻細胞懸液，取試驗所需的細胞懸液數量，26°C振蕩培養(培養溫度以25-26°C為宜，使用細胞培養瓶密閉培養。)，70轉/分，培養總時間為MOmin。所用培養液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉
ο如圖1所示為本發明方法分離的鯉魚腸細胞，多呈圓形，可見明顯的兩極特征；少量胞質物質豐富的粘液細胞；偶有橢圓形的紅細胞。腸細胞的純度和活力分別達到95%和 93%以上。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種無胃溫水性魚腸細胞懸浮培養方法，其特征在于，包括以下步驟Al、選擇體重400-600g的健康鯉魚或草魚，用2%烏拉坦溶液浸泡麻醉，待魚體翻倒后，切去頭部，破壞脊髓；按常規方法將魚體表消毒，無菌取出整個內臟，去除腸道表面的系膜組織，用Hanks液洗凈腸道內容物；A2、先將腸道一端扎住，用Hanks液充滿腸道，另一端用止血鉗夾住，在室溫下孵育10 分鐘；然后棄去溶液，以除去腸內可能殘余的食糜和黏液；A3、再用溶液-2充滿腸道，兩端用止血鉗夾住，在20°C下，40轉/分，振蕩孵育15分鐘；然后將腸腔內含有腸細胞的溶液收集起來；再用溶液-2充滿腸腔，兩端用止血鉗夾住， 在20°C下，40轉/分，振蕩孵育15分鐘；A4、將收集的腸細胞懸液混合在一起，在1500 Xg冷凍離心IOmin ；A5、收集的細胞沉淀用溶液-3重新懸浮，在25 °C振蕩孵化15min，腸細胞懸液經 100-μπι孔徑血液尼龍網過濾，在1500Xg冷凍離心IOmin ；細胞沉淀重新懸浮在溶液_4 中，供試驗使用；A6、細胞膜完整性用0. 5%臺盼藍染料排斥法檢測；細胞懸液和染料等體積混合，滴加在計數板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計數死細胞數和細胞總數，計算細胞活力；A7、細胞懸液在1500Xg冷凍離心lOmin，分別測定上清液和細胞沉淀乳酸脫氫酶 (LDH)的活性；A8、臺盼藍染色法確定細胞活力在90%以上，將細胞濃度調整為12X106cell/ml，用于培養實驗；輕輕混勻細胞懸液，取試驗所需的細胞懸液數量，^TC振蕩培養，70轉/分，培養總時間為MOmin。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液-2為=Hanks液+0.2mMEDTA ；所述溶液-3為DMEM培養液+42U膠原蛋白酶I ；所述溶液_4為DMEM培養液+0. 5%胎牛血清。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中分離液與組織的適宜比例為 1 10。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟8)分離腸細胞的懸浮培養條件處理包括以下內容使用細胞培養瓶密閉培養；所用培養液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素。
全文摘要
本發明公開了一種無胃溫水性魚腸細胞懸浮培養方法，將收集的腸細胞懸液混合在一起，在1500×g冷凍離心10min；收集的細胞沉淀用溶液-3重新懸浮，在25℃振蕩孵化15min，腸細胞懸液經100-μm孔徑血液尼龍網過濾，在1500×g冷凍離心10min；細胞沉淀重新懸浮在溶液-4中，供試驗使用；細胞膜完整性用0.5％臺盼藍染料排斥法檢測；細胞懸液和染料等體積混合，滴加在計數板上，蓋上蓋玻片，靜止1分鐘后計數死細胞數和細胞總數，計算細胞活力；細胞懸液在1500×g冷凍離心10min，分別測定上清液和細胞沉淀LDH的活性；輕輕混勻細胞懸液，取試驗所需的細胞懸液數量，26℃振蕩培養，70轉/分，培養總時間為240min。本發明首次提出無胃溫水性魚腸細胞懸浮培養方法。
文檔編號C12N5/071GK102367433SQ20111034883
公開日2012年3月7日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者馮琳, 劉揚, 周小秋, 姜俊, 姜維丹, 胡凱 申請人:四川農業大學