本發明涉及牛大力懸浮細胞培養技術領域。更具體地說，本發明涉及一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法。

背景技術：

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(Millettia speciosa Champ.)，又名大力薯、山蓮藕，始載于《生草藥性備要》，是《廣西中藥材標準》(1990年版)收載的地方藥材。牛大力以根入藥，味甘，平。歸肺、腎經。具有補虛潤肺、強筋活絡的功效，臨床證明其對腰肌勞損、風濕性關節炎、肺虛咳嗽、肺結核、慢性支氣管炎、慢性肝炎等慢性疾病有較好的療效。壯族民間常用于腰腿痛，發旺(風濕骨痛)，肺結核，慢性肝炎，慢性胃炎的治療。

現代研究發現，牛大力含有多糖、生物堿、香豆素和多種微量元素等成分，其中牛大力多糖是其主要活性成分，具有調節免疫系統、抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性，尤其是抗腫瘤方面療效明確，目前臨床研究顯示其對鼻咽癌、卵巢癌、肺癌、以及結腸癌具有良好的治療效果。同時牛大力多糖也是理想的免疫增強劑；生物堿和香豆素具有保肝、祛痰、鎮咳、鎮痛、鎮靜、解痙的作用，且對正常細胞均沒有毒副作用，在開發抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等藥物方面有著特殊的優勢，已成為提取企業競相開發的新目標，市場需求量巨大。自20世紀70年代起，作為主要原料被制藥企業加工成壯腰健腎丸、強力健身膠囊、桂龍藥膏、活絡止痛丸、強力追風透骨丸、舒筋健腰丸、益智康腦丸、抗風濕液等中成藥，在全國廣泛應用。近年來，牛大力又成為提取企業競相開發的新目標，提取多糖、高麗槐素等成分。

隨著牛大力需求量的不斷增加，野生資源已經枯竭，原材料嚴重供不應求。為了解決供需矛盾，人們嘗試采用人工栽培的方法擴大藥源，目前已發現有一些成功的研究報道，但仍存在著許多問題制約其規?；a，具體表現在種子苗不結薯或薯塊產量很不穩定，扦插苗成活率低，組培苗生根非常困難等方面。而且牛大力生長周期長(一般5年才形成產量)，以常規方法育種或育苗，需要花費很長時間，因繁殖系數小、耗種量大，導致發展速度很慢且生產成本增加，并且因病蟲害危害嚴重導致退化，嚴重影響了產量和品質。于是，如何利用高新技術研究獲得大量牛大力多糖等有效成分滿足臨床所需，并實現資源的可持續利用已迫在眉睫。我們針對牛大力開發后出現的資源可持續發展問題，在成功突破牛大力組培快繁技術的基礎上開展牛大力懸浮細胞培養體系的研究，以期探索出利用牛大力懸浮細胞直接生產有效成分的新途徑，有利于牛大力有效成分的開發和利用，同時為牛大力進一步利用體細胞雜交、遺傳轉化和突變體誘導等生物技術方法創造新的種質資源提供了新的途徑和方法。

技術實現要素：

本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。

本發明還有一個目的是提供一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，可以得到質量好、增殖產量高的穩定的牛大力懸浮細胞，為牛大力有效成分的開發和利用，以及為牛大力進一步利用體細胞雜交、遺傳轉化和突變體誘導等生物技術方法創造新的種質資源提供了新的途徑和方法。

為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，以開花后50～60天的牛大力果莢中取出的幼嫩子葉為培養材料，經誘導培養和繼代培養獲得繼代愈傷組織，再經懸浮細胞培養獲得穩定的牛大力懸浮細胞培養液。

優選的是，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，培養材料的獲得方法如下：選取開花后50～60天的牛大力果莢，在超凈工作臺上用棉花蘸取體積濃度為75％乙醇擦拭果莢，對果莢進行表面滅菌，然后小心剝開果莢，用滅菌的鑷子夾取果莢里面的未成熟種子，置于無菌碟子或無菌濾紙上，再用無菌解剖刀切開種皮，用無菌鑷子夾取子葉即得培養材料。

優選的是，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，所述誘導培養的方法如下：將培養材料接種至誘導培養基上于黑暗條件、24-28℃下誘導培養20-30天得到誘導愈傷組織；

所述誘導培養基的配方為：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

優選的是，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，所述繼代培養的方法如下：將誘導愈傷組織轉接至增殖培養基上于黑暗條件下進行繼代培養2-4次，至獲得繼代愈傷組織，每次繼代培養的時間為7-10天，培養溫度為24-28℃；

所述增殖培養基的配方為：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L蘆薈汁+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

優選的是，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，所述懸浮細胞培養的方法如下：將2-5g繼代愈傷組織接種至含有100-150ml液體培養基的三角瓶中，將三角瓶置于轉動頻率為90-100r/min、溫度為28℃的恒溫搖床上進行懸浮細胞培養，每10-15天轉接培養一次，轉接培養3-6次后，得到穩定的牛大力懸浮細胞培養液；

所述轉接培養即將三角瓶中的懸浮液用滅菌后的150目尼龍網過濾，將濾液轉接至含有100-150ml新的液體培養基的三角瓶中置于恒溫搖床上繼續培養；

所述液體培養基為MS培養基調整得到，其將MS培養基中的硝酸銨、硝酸鉀、無水氯化鈣、七水硫酸鎂和四水硫酸錳的含量調整為硝酸銨300～500mg/L、硝酸鉀2000～2500mg/L、無水氯化鈣50～80mg/L、七水硫酸鎂400～500mg/L、四水硫酸錳10～25mg/L，將磷酸二氫鉀更換為磷酸氫二鈉150～200mg/L，其余組分不變，然后再添加2,4-D 1～5mg/L、KT0.5～0.75mg/L、TDZ 0.5～1mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、PVP200～300mg/L、葡萄糖25～30g/L、椰子汁100～150mg/L、茉莉酸甲酯10～200μmol/L，pH 5.8。

優選的是，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，將得到的穩定的牛大力懸浮細胞培養液取2ml置于100-150ml新的液體培養基中培養10-15天進行擴繁培養，獲得增殖后的懸浮細胞培養液。

優選的是，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，所述液體培養基中茉莉酸甲酯的濃度為80-100μmol/L。

優選的是，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，培養材料經誘導培養之前，先經過如下前處理：將培養材料采用經剪裁的玉米苞葉全包覆，并用細線固定，將玉米苞葉連同培養材料一起采用滅菌過的針扎2-4個孔，再將其置入裝有前處理溶液的玻璃容器中，置于200-300高斯磁場中磁化處理2h，且在磁化處理的同時，播放輕音樂，且每播放30min之后暫停10min，播放音量控制在30-90db之間，磁化處理之后取出培養材料，用廚房紙擦干備用；

所述前處理溶液以磁化水為溶劑，配方為：0.5mg/L納米氧化鋅+0.1mg/L油菜素內酯+5g/L奶粉+1.5g/Lβ-葡聚糖+10mg/L生姜提取物。

本發明至少包括以下有益效果：

1)本發明提供的整套方法操作簡便，生產成本低，增殖速度快，增值率高；

2)本發明通過以開花后50～60天的牛大力果莢中幼嫩子葉為培養材料，經特定的誘導培養和繼代培養，得到淺綠色、顆粒狀、外觀濕潤、質地疏松的繼代愈傷組織，以進一步懸浮培養得到穩定的牛大力懸浮細胞液；

3)本發明通過在誘導培養之前對培養材料進行前處理，通過刺傷、特定的前處理溶液浸泡(納米氧化鋅具有抗菌抑菌的作用，與奶粉、β-葡聚糖一起在對牛大力培養材料表面形成一層膜，促進油菜素內酯和生姜提取物對牛大力培養材料的定向誘導)，并在磁化處理和輕音樂誘導的協同作用下，以進一步得到質量更好、產量多的愈傷組織，從而間接提高懸浮細胞的質量和產量。

本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1：

一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，以開花后50～60天的牛大力果莢中取出的幼嫩子葉為培養材料，經誘導培養和繼代培養獲得繼代愈傷組織，再經懸浮細胞培養獲得穩定的牛大力懸浮細胞培養液。

其中，培養材料的獲得方法如下：選取開花后50～60天的牛大力果莢，在超凈工作臺上用棉花蘸取體積濃度為75％乙醇擦拭果莢，對果莢進行表面滅菌，然后小心剝開果莢，用滅菌的鑷子夾取果莢里面的未成熟種子，置于無菌碟子或無菌濾紙上，再用無菌解剖刀切開種皮，用無菌鑷子夾取子葉即得培養材料。

其中，所述誘導培養的方法如下：將培養材料接種至誘導培養基上于黑暗條件、24℃下誘導培養20天得到誘導愈傷組織；

所述誘導培養基的配方為：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

其中，所述繼代培養的方法如下：將誘導愈傷組織轉接至增殖培養基上于黑暗條件下進行繼代培養2次，至獲得繼代愈傷組織，每次繼代培養的時間為7天，培養溫度為24℃，所得繼代愈傷組織為淺綠色、顆粒狀、外觀濕潤、質地疏松，能滿足懸浮細胞培養的需要；

所述增殖培養基的配方為：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L蘆薈汁+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

其中，所述懸浮細胞培養的方法如下：將2g繼代愈傷組織接種至含有100ml液體培養基的三角瓶中，將三角瓶置于轉動頻率為90r/min、溫度為28℃的恒溫搖床上進行懸浮細胞培養，每10天轉接培養一次，轉接培養3次后，得到穩定的牛大力懸浮細胞培養液；

所述轉接培養即將三角瓶中的懸浮液用滅菌后的150目尼龍網過濾，將濾液轉接至含有100ml新的液體培養基的三角瓶中置于恒溫搖床上繼續培養；

所述液體培養基為MS培養基調整得到，其將MS培養基中的硝酸銨、硝酸鉀、無水氯化鈣、七水硫酸鎂和四水硫酸錳的含量調整為硝酸銨300mg/L、硝酸鉀2000mg/L、無水氯化鈣50mg/L、七水硫酸鎂400mg/L、四水硫酸錳10mg/L，將磷酸二氫鉀更換為磷酸氫二鈉150mg/L，其余組分不變，然后再添加2,4-D 1mg/L、KT0.5mg/L、TDZ 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、PVP200mg/L、葡萄糖25g/L、椰子汁100mg/L、茉莉酸甲酯10μmol/L，pH 5.8。MS培養基為常規培養常用的MS基本培養基，除了硝酸銨、硝酸鉀、無水氯化鈣、七水硫酸鎂和四水硫酸錳的含量調整，以及將磷酸二氫鉀的170mg/L濃度更換為磷酸氫二鈉150mg/L，以及額外增加的2,4-D 1mg/L、KT0.5mg/L、TDZ 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、PVP200mg/L、葡萄糖25g/L、椰子汁100mg/L、茉莉酸甲酯10μmol/L的成分外，其他均與MS基本培養基中的成分以及組成相同。

本發明中誘導愈傷組織與繼代愈傷組織的命名是為了區分分別從誘導培養得到的愈傷組織和繼代培養得到的愈傷組織，繼代培養過程是對誘導得到的愈傷組織不僅僅是擴繁增殖，更重要的是進一步篩選出適合于懸浮細胞培養的愈傷組織的過程。

實施例2：

一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，以開花后50～60天的牛大力果莢中取出的幼嫩子葉為培養材料，經誘導培養和繼代培養獲得繼代愈傷組織，再經懸浮細胞培養獲得穩定的牛大力懸浮細胞培養液。

其中，培養材料的獲得方法如下：選取開花后50～60天的牛大力果莢，在超凈工作臺上用棉花蘸取體積濃度為75％乙醇擦拭果莢，對果莢進行表面滅菌，然后小心剝開果莢，用滅菌的鑷子夾取果莢里面的未成熟種子，置于無菌碟子或無菌濾紙上，再用無菌解剖刀切開種皮，用無菌鑷子夾取子葉即得培養材料。

其中，所述誘導培養的方法如下：將培養材料接種至誘導培養基上于黑暗條件、28℃下誘導培養30天得到誘導愈傷組織；

所述誘導培養基的配方為：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

其中，所述繼代培養的方法如下：將誘導愈傷組織轉接至增殖培養基上于黑暗條件下進行繼代培養4次，至獲得繼代愈傷組織，每次繼代培養的時間為10天，培養溫度為28℃，所得繼代愈傷組織為淺綠色、顆粒狀、外觀濕潤、質地疏松，能滿足懸浮細胞培養的需要；

所述增殖培養基的配方為：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L蘆薈汁+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

其中，所述懸浮細胞培養的方法如下：將5g繼代愈傷組織接種至含有150ml液體培養基的三角瓶中，將三角瓶置于轉動頻率為100r/min、溫度為28℃的恒溫搖床上進行懸浮細胞培養，每15天轉接培養一次，轉接培養6次后，得到穩定的牛大力懸浮細胞培養液；

所述轉接培養即將三角瓶中的懸浮液用滅菌后的150目尼龍網過濾，將濾液轉接至含有100-150ml新的液體培養基的三角瓶中置于恒溫搖床上繼續培養；

所述液體培養基為MS培養基調整得到，其將MS培養基中的硝酸銨、硝酸鉀、無水氯化鈣、七水硫酸鎂和四水硫酸錳的含量調整為硝酸銨500mg/L、硝酸鉀2500mg/L、無水氯化鈣80mg/L、七水硫酸鎂500mg/L、四水硫酸錳25mg/L，將磷酸二氫鉀更換為磷酸氫二鈉200mg/L，其余組分不變，然后再添加2,4-D 5mg/L、KT0.75mg/L、TDZ 1mg/L、NAA0.5mg/L、PVP300mg/L、葡萄糖30g/L、椰子汁150mg/L、茉莉酸甲酯200μmol/L，pH 5.8。

實施例3：

一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，以開花后50～60天的牛大力果莢中取出的幼嫩子葉為培養材料，經誘導培養和繼代培養獲得繼代愈傷組織，再經懸浮細胞培養獲得穩定的牛大力懸浮細胞培養液。

其中，培養材料的獲得方法如下：選取開花后50～60天的牛大力果莢，在超凈工作臺上用棉花蘸取體積濃度為75％乙醇擦拭果莢，對果莢進行表面滅菌，然后小心剝開果莢，用滅菌的鑷子夾取果莢里面的未成熟種子，置于無菌碟子或無菌濾紙上，再用無菌解剖刀切開種皮，用無菌鑷子夾取子葉即得培養材料。

其中，所述誘導培養的方法如下：將培養材料接種至誘導培養基上于黑暗條件、26℃下誘導培養25天得到誘導愈傷組織；

所述誘導培養基的配方為：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

其中，所述繼代培養的方法如下：將誘導愈傷組織轉接至增殖培養基上于黑暗條件下進行繼代培養3次，至獲得繼代愈傷組織，每次繼代培養的時間為7-10天，培養溫度為24-28℃，所得繼代愈傷組織為淺綠色、顆粒狀、外觀濕潤、質地疏松，能滿足懸浮細胞培養的需要；

所述增殖培養基的配方為：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L蘆薈汁+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

其中，所述懸浮細胞培養的方法如下：將3g繼代愈傷組織接種至含有120ml液體培養基的三角瓶中，將三角瓶置于轉動頻率為90r/min、溫度為28℃的恒溫搖床上進行懸浮細胞培養，每12天轉接培養一次，轉接培養4次后，得到穩定的牛大力懸浮細胞培養液；

所述轉接培養即將三角瓶中的懸浮液用滅菌后的150目尼龍網過濾，將濾液轉接至含有120ml新的液體培養基的三角瓶中置于恒溫搖床上繼續培養；

所述液體培養基為MS培養基調整得到，其將MS培養基中的硝酸銨、硝酸鉀、無水氯化鈣、七水硫酸鎂和四水硫酸錳的含量調整為硝酸銨400mg/L、硝酸鉀2200mg/L、無水氯化鈣65mg/L、七水硫酸鎂450mg/L、四水硫酸錳18mg/L，將磷酸二氫鉀更換為磷酸氫二鈉175mg/L，其余組分不變，然后再添加2,4-D 3mg/L、KT 0.65mg/L、TDZ 0.8mg/L、NAA 0.35mg/L、PVP250mg/L、葡萄糖28g/L、椰子汁125mg/L、茉莉酸甲酯100μmol/L，pH 5.8。

實施例4：

在實施例3的基礎上，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，將得到的穩定的牛大力懸浮細胞培養液取2ml置于100ml新的液體培養基中培養10天進行擴繁培養，獲得增殖后的懸浮細胞培養液。

實施例5：

在實施例3的基礎上，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，將得到的穩定的牛大力懸浮細胞培養液取2ml置于150ml新的液體培養基中培養15天進行擴繁培養，獲得增殖后的懸浮細胞培養液。

實施例6：

在實施例5的基礎上，所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，培養材料經誘導培養之前，先經過如下前處理：將培養材料采用經剪裁的玉米苞葉全包覆，并用細線固定，將玉米苞葉連同培養材料一起采用滅菌過的針扎2-4個孔，再將其置入裝有前處理溶液的玻璃容器中，置于200-300高斯磁場中磁化處理2h，且在磁化處理的同時，播放輕音樂，且每播放30min之后暫停10min，播放音量控制在30-90db之間，磁化處理之后取出培養材料，用廚房紙擦干備用；

所述前處理溶液以磁化水為溶劑，配方為：0.5mg/L納米氧化鋅+0.1mg/L油菜素內酯+5g/L奶粉+1.5g/Lβ-葡聚糖+10mg/L生姜提取物。其中生姜提取物為市售。

為了說明本發明的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法的技術效果，本發明的申請人針對實施例3的方法進行牛大力懸浮細胞培養，將實施例3中液體培養基中茉莉酸甲酯的濃度設置為10、40、80、100、130、170、200μmol/L，并同時針對實施例6的方法進行牛大力懸浮細胞培養，均成功誘導出符合懸浮細胞培養需要的繼代愈傷組織，且得到的愈傷組織增殖快、質量好，并獲得穩定的懸浮細胞培養液，再將得到的穩定的牛大力懸浮細胞培養液通過實施例5的方法進行一次擴繁增殖處理，然后將其采用滅菌后的150目尼龍網過濾后于60℃下干燥12h得到干燥后的懸浮細胞，得到一次擴繁后的牛大力懸浮細胞的干樣品重量為0.19～0.45μg/每毫升培養物(這里的培養物是指擴繁增殖后的牛大力懸浮細胞培養液)，具體見下表。

表1不同實施方案下擴繁一次得到的牛大力懸浮細胞液的干樣品重

上述實施方案說明本發明的方法不僅能獲得穩定的牛大力懸浮細胞培養液，并且懸浮細胞增殖倍數高，另外，由表1可以看出，在懸浮細胞培養時，液體培養基中茉莉酸甲酯的濃度為80-170μmol/L時，得到的牛大力懸浮細胞的產量更多，其中以茉莉酸甲酯濃度為80-100μmol/L更為適宜，并且，實施例6相對實施例3來說，增加了牛大力培養材料的前處理，從結果可以看出，前處理的不同，直接導致了牛大力懸浮細胞的產量增加。

對比例1：

一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，在實施例3的基礎上，以嫩葉或帶芽莖段為培養材料，接種到誘導培養基中進行誘導培養，所述愈傷組織誘導培養基的配方和誘導培養方法同實施例3。

本對比例1的方法誘導出的愈傷組織屬于致密型，經繼代培養后無法獲得質地疏松的愈傷組織，無法進一步進行懸浮細胞培養，說明并不是任意牛大力的組織部分就能誘導出懸浮細胞的。

對比例2：

一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，在實施例3的基礎上，將所述誘導培養基的配方替換為：MS、0.5mg/LKT、0.5mg/L TDZ、0.2mg/L NAA。除誘導培養基的配方外，其他方法與實施例3相同。

本對比例2的方法能僅能誘導出少量黃白色致密型的愈傷組織，經繼代培養后無法獲得較多質地疏松的愈傷組織，無法培養得到質量好、產量高的懸浮細胞。

對比例3：

一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法，在實施例3的基礎上，所述懸浮細胞培養液體培養基的配方替換為：MS、2,4-D 1～5mg/L、KT0.5～0.75mg/L、TDZ 0.5～1mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、PVP200～300mg/L、葡萄糖25～30g/L。

除懸浮細胞培養液體培養基的配方外，其他與實施例3相同。

本對比例3的方法培養一段時間后懸浮細胞開始出現褐變死亡的現象，經轉接培養多次無效，無法得到穩定量多的懸浮細胞培養液。

盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例。