Nk細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3-CD56+NK細(xì)胞的方法，步驟為：用含自體血漿的無血清培養(yǎng)基調(diào)整分離的PBMC濃度加入Anti-CD16抗體、IL-2、IL-15后轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，后再加入Anti-CD3抗體、Anti-CD137抗體，根據(jù)細(xì)胞的生長情況，每隔2天補(bǔ)充含自體血漿、IL-2和IL-15的無血清培養(yǎng)基，控制細(xì)胞濃度約1.5×106/ml，培養(yǎng)14～21天后可同時(shí)獲得大量較高純度的CD3+CD56+CIK和CD3-CD56+NK細(xì)胞，且總細(xì)胞數(shù)量能達(dá)到臨床用于腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療所需細(xì)胞數(shù)量的有效值。本發(fā)明簡便、有效，細(xì)胞殺傷活性高。
【專利說明】同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3XD56+NK細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種由外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3XD56+NK細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其死亡率呈逐年上升趨勢。腫瘤的傳統(tǒng)治療手段主要包括手術(shù)、化療及放療。但傳統(tǒng)的治療手段對腫瘤細(xì)胞的殺傷缺乏特異性，對正常的組織細(xì)胞亦有損傷，伴隨著明顯的毒副反應(yīng)。近年來，隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，誕生了腫瘤治療的第四種模式，即生物治療。生物治療能夠更為特異性的殺滅腫瘤細(xì)胞，對正常組織細(xì)胞無損傷，并且可通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫記憶效應(yīng)進(jìn)而預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是手術(shù)、化療、放療的有益補(bǔ)充。
[0003]腫瘤的生物治療中一種重要的方法就是過繼性細(xì)胞免疫療法(Adoptivecellular immunotherapy, ACI),即通過分離患者自身免疫細(xì)胞,體外經(jīng)過多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)激活或通過基因改造后擴(kuò)增，獲得大量具有強(qiáng)大抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞并回輸?shù)交颊唧w內(nèi)通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或者通過激活機(jī)體的免疫反應(yīng)而間接殺傷腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞免疫治療可以，有效降低惡性腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，綜合擴(kuò)增機(jī)體免疫功能對抗癌細(xì)胞，清除傳統(tǒng)治療后微小殘留病灶和體內(nèi)游離癌細(xì)胞，顯著改善患者的生活質(zhì)量，有效延長患者的生存期，而且無任何毒副作用和治療痛苦，與傳統(tǒng)治療聯(lián)合應(yīng)用于臨床治療癌癥效果極佳而越來越受到關(guān)注。
[0004]生物治療中應(yīng)用的免疫細(xì)胞主要有:淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(IymPhokineactivated killer, LAK)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cell,CIK)和自然殺傷細(xì)胞(naturalkiller cell, NK)、NKT 細(xì)胞(Natural Killer T cells, NKT)等，以其殺傷腫瘤細(xì)胞活性高、殺傷譜廣等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的綜合治療中顯示出重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0005]CIK細(xì)胞(細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)是以CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的一群具有非特異性殺傷功能的細(xì)胞。由于其主要效應(yīng)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性，和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。由于CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)，是臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細(xì)胞。
[0006]NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)，是屬淋巴細(xì)胞譜系的一類非特異性免疫細(xì)胞，其無須預(yù)先接觸抗原即可殺傷被病毒感染的宿主細(xì)胞，是人體免疫系統(tǒng)的主要成員，不僅對抗病毒感染起著重要的作用，而且活化后的NK細(xì)胞可合成和分泌多種細(xì)胞因子，與機(jī)體的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，能廣泛識(shí)別、迅速溶解、殺傷、摧毀癌細(xì)胞，對腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的元兇一腫瘤干細(xì)胞具有顯著的殺傷作用。
[0007]由于CIK、NK細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，近年來，隨著免疫細(xì)胞制備技術(shù)的進(jìn)步和人們對免疫細(xì)胞治療的認(rèn)知和接受度的提高，CIK及NK細(xì)胞在臨床腫瘤治療上都有廣泛應(yīng)用，但均是通過體外對患者的CIK、NK免疫細(xì)胞分別進(jìn)行擴(kuò)增，采血量大，成本高等因素成為多種細(xì)胞免疫治療發(fā)展的瓶頸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種新的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法，該方法能夠利用一個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)，于體外培養(yǎng)條件下同時(shí)獲得大量應(yīng)用安全、純度較高、活性強(qiáng)的⑶3+⑶56+CIK細(xì)胞和⑶3td56+nk細(xì)胞。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種同時(shí)高效擴(kuò)增⑶3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3_CD56+NK細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該方法的步驟為:
[0010]第0天，取外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC，將分離得到的PBMC用第一培養(yǎng)基調(diào)整PBMC濃度為2 X 106/ml,制成PBMC細(xì)胞懸液，然后往PBMC細(xì)胞懸液加入Ant1-⑶16抗體、IL-2、和IL-15，之后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中于37°C、5% C02、100%濕度條件下開始培養(yǎng)，所述第一培養(yǎng)基為含自體血漿的無血清培養(yǎng)基；
[0011]第1天，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入Ant1-CD3抗體，Anti_CD137抗體，在37°C、5%C02、100%濕度條件下培養(yǎng)；
[0012]第3天，往細(xì)胞懸液中半量補(bǔ)加第二培養(yǎng)基，所述第二培養(yǎng)基為含自體血漿、IL-2、IL-15的無血清培養(yǎng)基；
[0013]第5天，離心收集細(xì)胞，并用所述第二培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5X106/ml，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)裝置中；
[0014]繼續(xù)培養(yǎng)和收獲:以后每隔2天取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果往所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置中補(bǔ)充所述第二培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5X106/ml，37°C、5% C02、100%濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)14?21天后，離心收集獲得的CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3_CD56+NK細(xì)胞。
[0015]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法僅利用一個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)，在一個(gè)培養(yǎng)步驟中即可于體外培養(yǎng)條件下，從自體外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)同時(shí)高效擴(kuò)增獲得大量應(yīng)用安全、純度較高、活性強(qiáng)的⑶3+CD56+CIK細(xì)胞和⑶3XD56+NK細(xì)胞。此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的方法簡單易操作，且成本較低，適于廣泛推廣應(yīng)用。
[0016]其中，需要說明的是，在本申請中所使用的術(shù)語“自體血漿”是指，與所述外周血來源相同的供體的血漿。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中自體血漿的濃度均為1% -20%體積。根據(jù)本發(fā)明的一具體示例，所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中自體血漿的濃度均為1體積％。由此，目的細(xì)胞擴(kuò)增效果好。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述Ant1-CD16抗體的終濃度均為50ng?lmg/ml。根據(jù)本發(fā)明的一具體示例，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述Ant1-⑶16抗體的終濃度均為500ng/ml。由此，目的細(xì)胞擴(kuò)增效果好。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述IL-2的終濃度均為1000?6000U/mL。根據(jù)本發(fā)明的一具體不例，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述IL-2的終濃度均為1000U/mL。由此，目的細(xì)胞擴(kuò)增效果好。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述IL-15的終濃度均為lng/ml?100ng/ml。根據(jù)本發(fā)明的一具體示例，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述IL-15的終濃度均為20ng/ml。由此，目的細(xì)胞擴(kuò)增效果好。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第I天，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入的所述Ant1-⑶3抗體的終濃度為1ng?lmg/ml。根據(jù)本發(fā)明的一具體示例，第I天，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入的Ant1-⑶3抗體的終濃度為50ng/ml。由此，目的細(xì)胞擴(kuò)增效果好。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第I天,細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入的所述Ant1-⑶137抗體的終濃度為1ng?lmg/ml。根據(jù)本發(fā)明的一具體示例，第I天，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入的Ant1-⑶137抗體的終濃度為500ng/ml。由此，目的細(xì)胞擴(kuò)增效果好。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置是G-REX 100L培養(yǎng)裝置。其中，需要說明的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置在培養(yǎng)過程中呈封閉狀態(tài)。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所述繼續(xù)培養(yǎng)和收獲的步驟中，當(dāng)培養(yǎng)體系的總細(xì)胞計(jì)數(shù)不小于5xl09時(shí)，離心收集獲得的CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞。由此，能夠有效收集獲得目的細(xì)胞。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述無血清培養(yǎng)可以是AM-V無血清培養(yǎng)基、日本寶日醫(yī)的 GCT551 和 LONZA 的 X-VIV015，以色列 BI 公司的 B10TARGET-1 Without L-Glutamine
培養(yǎng)基的至少一種。
[0026]此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過本發(fā)明的方法獲得的兩種細(xì)胞，可以用于制備細(xì)胞治療產(chǎn)品，進(jìn)而用于臨床腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療。
[0027]本發(fā)明的同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和⑶3TD56+NK細(xì)胞的方法，由于在一個(gè)培養(yǎng)體系中就能同時(shí)誘導(dǎo)和擴(kuò)增出2種效應(yīng)細(xì)胞，相對于傳統(tǒng)的方法需要對2種效應(yīng)細(xì)胞同時(shí)平行地實(shí)施培養(yǎng)步驟，其成本降低，方法簡單，易于操作，擴(kuò)增效率高，易于推廣，相對于應(yīng)用廣泛的常規(guī)方法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，細(xì)胞群的殺傷活性和細(xì)胞因子的分泌都有大幅度提聞。
[0028]其中，需要說明的是，本發(fā)明所述的“第O天”，指的是采樣當(dāng)天，第I天指的是采樣后的第一天，第3天，第5天……以此類推。
[0029]此外，本發(fā)明所述的“CD3+CD56+CIK細(xì)胞”是指通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)記為⑶3+⑶56+的CIK細(xì)胞(即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，又稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞)，“⑶3TD56+NK細(xì)胞”是指通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)記為CD3XD56+的NK細(xì)胞(即自然殺傷細(xì)胞)。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的方法簡便、有效、能在一個(gè)培養(yǎng)步驟中從自體外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)同時(shí)高效擴(kuò)增獲得⑶3+⑶56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，并且與常規(guī)的培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0031]1、步驟中采用了新型細(xì)胞培養(yǎng)裝置G-rex 100L,其特殊的底部換氣改善了常規(guī)方法用細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)過程由于培養(yǎng)基體積的不斷增加而導(dǎo)致細(xì)胞呼吸困難等問題，大幅度提升了細(xì)胞擴(kuò)增效率。
[0032]2、步驟中僅僅通過Ant1-CD3，Anti_CD16，Anti_CD137三種抗體組合，在一個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)里實(shí)現(xiàn)了對CD3+CD56+CIK細(xì)胞和⑶3XD56+NK細(xì)胞的同時(shí)激活。⑶3VD56+CIK主要細(xì)胞是通過誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞分化而來，Ant1-CD3抗體作為抗原刺激提供了 T細(xì)胞活化的第一信號(hào)來激活T細(xì)胞；CD3_CD56+NK細(xì)胞既不是T細(xì)胞，也不是B細(xì)胞，但⑶3TD56+NK細(xì)胞可表達(dá)低親和性的IgGFc受體Fe Y R III (⑶16)，CD3TD56+NK細(xì)胞缺乏⑶3分子，但它能表達(dá)⑶3的?鏈分子，并與⑶16 —起組成IgGFc低親和力受體來激活ΝΚ細(xì)胞；而⑶137/⑶137L則是TNFR/TNF超家族成員之一，與ant1-⑶3和ant1-⑶16抗體相互作用共同介導(dǎo)的共刺激信號(hào)同樣可刺激細(xì)胞的增殖。本發(fā)明所述的方法，通過三種單抗相互間的協(xié)同作用刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞高通量地活化增殖，從而使得一個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)中同時(shí)獲得滿足臨床需要的cd3+cd56+cik 細(xì)胞和 cd3_cd56+nk 細(xì)胞數(shù)量。
[0033]3、步驟中僅僅通過IL-2和IL-15兩種細(xì)胞因子就實(shí)現(xiàn)了對⑶3+⑶56+CIK細(xì)胞和⑶3TD56+NK細(xì)胞的擴(kuò)增，IL-2可刺激NK細(xì)胞表達(dá)大量的IL-2R α鏈，從而使ΝΚ細(xì)胞大量增殖，并且在IL-2刺激下ΝΚ細(xì)胞表達(dá)黏附分子，使CD3_CD56+NK胞質(zhì)中的顆粒增加并促進(jìn)絲氨酸酯酶mRNA的表達(dá)，從而提高CD3_CD56+NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性；IL_15是一種多功能的細(xì)胞因子，是造血前體細(xì)胞向NK細(xì)胞定向發(fā)育的決定性因子，具有促進(jìn)CD3_CD56+NK細(xì)胞增生，上調(diào)NK細(xì)胞毒活性，促進(jìn)NK細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)和趨化作用，通過兩種因子間的相互協(xié)同作用，不但可以促進(jìn)CD3_CD56+NK細(xì)胞的擴(kuò)增，還可以大幅度提高⑶3+⑶56+CIK細(xì)胞的毒活性。
[0034]4、利用細(xì)胞因子組合同時(shí)誘導(dǎo)擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3_CD56+NK細(xì)胞技術(shù)，可以提高傳統(tǒng)CIK群體里的cd3+cd56+cik細(xì)胞和cd3_cd56+nk細(xì)胞含量，協(xié)同和增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗腫瘤療效。
[0035]5、本發(fā)明方法所得到的細(xì)胞，具有殺傷活性和分泌細(xì)胞因子的能力，細(xì)胞培養(yǎng)全程采用無血清培養(yǎng)基，保證細(xì)胞數(shù)量和活性外，增加了臨床應(yīng)用的安全性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為常規(guī)組和實(shí)驗(yàn)組兩種不同方法所得細(xì)胞的培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞增殖倍數(shù)的關(guān)系圖；
[0037]圖2中左圖為流式細(xì)胞分析儀檢測常規(guī)組細(xì)胞分別表達(dá)CD3+CD56+CIK細(xì)胞及表達(dá)⑶3TD56+NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖，右圖為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別表達(dá)⑶3+⑶56+CIK細(xì)胞及表達(dá)cd3_cd56+nk細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖；
[0038]圖3中左圖為流式細(xì)胞分析儀檢測實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與靶細(xì)胞作用后分泌細(xì)胞因子IFN-y的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖，右圖為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自發(fā)分泌細(xì)胞因子IFN-γ的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖；
[0039]圖4中左圖為流式細(xì)胞分析儀檢測常規(guī)組細(xì)胞與靶細(xì)胞作用后分泌細(xì)胞因子IFN-y的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖，右圖為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自發(fā)分泌細(xì)胞因子IFN-γ的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖；
[0040]圖5中左圖流式細(xì)胞分析儀檢測實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與靶細(xì)胞作用后分泌細(xì)胞因子⑶107a的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖，右圖為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自發(fā)分泌⑶107a的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖；
[0041]圖6中左圖為流式細(xì)胞分析儀檢測常規(guī)組細(xì)胞與靶細(xì)胞作用后分泌細(xì)胞因子⑶107a的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖，右圖為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自發(fā)分泌⑶107a的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0042]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0043]實(shí)施例1:
[0044]一、從外周血PBMC細(xì)胞同時(shí)高效擴(kuò)增OT3+CD56+CIK細(xì)胞和⑶3XD56+NK細(xì)胞的方法(以下簡稱實(shí)驗(yàn)組)。
[0045]第O 天:
[0046]I采集健康人外周血(10ml),用淋巴細(xì)胞分離液(Axis-Shield公司，挪威)通過梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)收集分離管上層黃色血漿作為自體血漿。
[0047]2用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) (GIBC0公司，美國)，洗滌細(xì)胞兩次，用臺(tái)盼藍(lán)(GIBC0公司，美國)拒染法檢測細(xì)胞活性并計(jì)數(shù)。
[0048]3將分離所得的外周血單核細(xì)胞1.17x108細(xì)胞懸浮在含培養(yǎng)基體積I %自體血漿的AM-V無血清培養(yǎng)基中(GIBC0公司，美國)，使得細(xì)胞初始接種濃度為2.5X106/ml，共47ml。
[0049]4將步驟3所得外周血單核細(xì)胞(2.5X106/ml，共47ml)接種至一個(gè)175cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Greiner B1-one德國)中。
[0050]5將Ant1-CD16抗體以終濃度為500ng/ml添加至步驟4的細(xì)胞懸液中，在37°C，5% C02,100%濕度下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0051]第I天:
[0052]6細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后將Ant1-⑶3抗體、Ant1-⑶137抗體添加至細(xì)胞懸液中，使得Ant1-CD3 抗體終濃度 50ng/ml，Anti_CD137 抗體終濃度 500ng/ml，在 37°C，5% CO2,100%濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。
[0053]第2 天:
[0054]7每隔2天取樣通過臺(tái)盼蘭拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞和統(tǒng)計(jì)活率，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)情況，補(bǔ)加含
[0055]培養(yǎng)基體積I %自體血漿、1000U/ml IL-2和20ng/ml IL-15的AM-V無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5X 106/ml,37°C>5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。
[0056]第5 天:
[0057]8離心收集細(xì)胞，含培養(yǎng)基體積I %自體血漿、1000U/ml IL-2和20ng/mlIL-15的AM-V無血清培養(yǎng)基并將細(xì)胞重懸并調(diào)整細(xì)胞密度至1.5X 106/ml，轉(zhuǎn)入G-rex100L(wilson公司，美國)細(xì)胞培養(yǎng)裝置中
[0058]第6-14 天:
[0059]9以后每隔2天取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果往封閉的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中補(bǔ)加培養(yǎng)基含I體積％自體血漿、1000U/ml IL-2和20ng/ml IL-15的AM-V無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5X 106/ml,37°C>5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)至第14天。
[0060]二、從外周血PBMC細(xì)胞中常規(guī)擴(kuò)增CIK培養(yǎng)方法(以下簡稱常規(guī)組)
[0061]將采集的外周血單個(gè)核細(xì)胞用AM-V無血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度為IXlO6 U/ml，第O天加入IFN- Y，使得IFN- Y在培養(yǎng)基中的終濃度為1000U/ml，隨后將培養(yǎng)液置于37°C，CO2濃度為5%，濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
[0062]第I 天加入 IL-1 a、IL-2 以及 Ant1-CD3 抗體，使得 IL-1 a、IL-2 以及 Ant1-CD3抗體在AM-V無血清培養(yǎng)基中的終濃度分別為300U/ml、1000U/ml以及500U/ml，繼續(xù)在37°C,C02濃度為5%，濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0063]以后每隔2天取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果添加含IL-2的新鮮AM-V無血清培養(yǎng)基，使得IL-2在新添加培養(yǎng)基中的終濃度為1000U/ml，調(diào)整細(xì)胞濃度保持在1.5X 106/ml，當(dāng)培養(yǎng)體積大于200ml后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)至第14天。
[0064]三、結(jié)果測試
[0065]在第14天收集由本實(shí)施例所述實(shí)驗(yàn)組及常規(guī)組方法所培養(yǎng)的細(xì)胞用于各項(xiàng)測試。
[0066]從以下幾個(gè)方面比較這兩種制備方法獲得的CD3+CD56+CIK細(xì)胞和⑶3_CD56+NK細(xì)胞的差異性，常規(guī)組是以本實(shí)施例步驟二所提供的方法制備的cd3+cd56+cik細(xì)胞和cd3_cd56+nk細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組是以本實(shí)施例步驟一所提供的方法制備的cd3+cd56+cik細(xì)胞和cd3_cd56+nk細(xì)胞。
[0067]1:細(xì)胞增殖倍數(shù)的測定
[0068]將取得的細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)(GIBC0，美國)染色后再用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，將當(dāng)前的細(xì)胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，數(shù)值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。用此方法可以動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的增殖狀況，具體情況見圖1，從圖1可以看出，實(shí)驗(yàn)組和常規(guī)組細(xì)胞增殖速度相當(dāng)，細(xì)胞總數(shù)能夠滿足臨床應(yīng)用。
[0069]2:流式檢測兩組細(xì)胞(表達(dá)⑶3+⑶56+CIK細(xì)胞及表達(dá)⑶3TD56+NK細(xì)胞)表型分析
[0070]兩組細(xì)胞在培養(yǎng)的第14天各取5X105細(xì)胞至1.5ml離心管中，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入100μ 1 PBS重懸細(xì)胞，然后加入FITC Mouse Ant1-Human CD3檢測抗體20 μ 1 (BD Pharmingen,美國)，PE Mouse Ant1-Human CD56 檢測抗體 20 μ 1 (BD Pharmingen,美國)進(jìn)行雙標(biāo)記，于室溫暗處孵育20分鐘，PBS洗2次，洗去多余抗體，最后用500ul PBS將細(xì)胞重懸，通過流式細(xì)胞分析儀(Millipore guava easyCyte 6HT-2L,美國)測定，結(jié)果見圖2。圖2的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的⑶3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3_CD56+NK細(xì)胞百分比例均比常規(guī)組有大幅度的提聞。
[0071]3:流式檢測兩組細(xì)胞中細(xì)胞因子IFN-Y的表達(dá)水平
[0072]取對數(shù)生長期的K562腫瘤細(xì)胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢)至無菌15ml離心管中，1500rpm，離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用含培養(yǎng)基體積10% FBS的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X 106/ml，接種細(xì)胞于一個(gè)96孔平底板中，100 μ 1/孔，接種2孔，置于37°C，C02濃度為5%，濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)作為靶細(xì)胞待用；
[0073]分別收集培養(yǎng)14天的實(shí)驗(yàn)組和常規(guī)組培養(yǎng)細(xì)胞，用含培養(yǎng)基體積10% FBS的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5X106/ml，作為效應(yīng)細(xì)胞。移液器吹打混勻細(xì)胞后各取100μ 1，5X105細(xì)胞加至前述96孔板中100 μ 1的5X 105靶細(xì)胞中，使效靶比為1:1 (效靶比:效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量與祀細(xì)胞數(shù)量之比，以下同此)，按每ml細(xì)胞懸液加入BFA 1 μ 1 (ProteinTransport Inhibitor (Containing Brcfcldin A), BD Pharmingen,美國)，并設(shè)未與月中瘤細(xì)胞反應(yīng)的兩組細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞空白對照，37°C，5% C02共孵育4小時(shí)后各取混合細(xì)胞1x106,PBS 洗 2 次，每管加入 PE Mouse Ant1-Human CD56 檢測抗體 20 μ 1 (BD Pharmingen,美國)，室溫孵育 30min,加固定劑 500 μ 1 (fixat1n/permeabilizat1n Kit, BD Pharmingen,美國)室溫孵育 15min, PBS 洗，加入破膜劑 500 μ 1 (fixat1n/permeabilizat1n Kit, BDPharmingen,美國)室溫 5Min,加入 FITC Mouse Ant1-HumanlFN- y 檢測抗體 20μ1(Ε?Pharmingen，美國)，室溫孵育15min，PBS洗2次，最后用500 μ IPBS將細(xì)胞重懸，通過流式細(xì)胞分析儀測定CD56+細(xì)胞內(nèi)IFN- Y的表達(dá)水平，結(jié)果見圖3，圖4。
[0074]最終細(xì)胞表達(dá)IFN-Y百分?jǐn)?shù)計(jì)算方法=加靶細(xì)胞刺激的IFN-Y陽性率(% ) -1FN- Y自發(fā)表達(dá)率)
[0075]根據(jù)最終表達(dá)細(xì)胞IFN-Y百分?jǐn)?shù)計(jì)算方法，從圖3可以看出，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中⑶56+效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)IFN-Y的百分?jǐn)?shù)為34.18%，而圖4中常規(guī)組中⑶56+效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)IFN-Y的百分?jǐn)?shù)僅為1.28%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)IFN-Y的細(xì)胞數(shù)是常規(guī)組的26.7倍，說明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-Y表達(dá)水平更高。
[0076]4:流式檢測兩組細(xì)胞的脫顆粒(表達(dá)⑶107a)能力
[0077]溶酶體相關(guān)膜蛋白-1 (LAMP-1或⑶107a)是一種高糖基化的蛋白，約占溶酶體膜蛋白的50 %。正常NK細(xì)胞及CIK表面幾乎不表達(dá)⑶107a分子，但當(dāng)NK及CIK主要效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)，毒性顆粒將到達(dá)漿膜面并與細(xì)胞膜融合，引起顆粒內(nèi)容物釋放，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的死亡，隨著脫顆粒的發(fā)生，⑶107a分子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，且⑶107a分子的表達(dá)上調(diào)與穿孔素的分泌一致。因此，CD107a分子陽性表達(dá)的CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞可代表具有殺傷活性的效應(yīng)細(xì)胞。
[0078]取對數(shù)生長期的K562腫瘤細(xì)胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢)至無菌15ml離心管中，1500rpm，離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用含培養(yǎng)基體積10% FBS的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X 106/ml，接種細(xì)胞于一個(gè)96孔平底板中，100 μ I/孔，接種2孔，置于37°C，CO2濃度為5%，濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)作為靶細(xì)胞待用；
[0079]分別收集培養(yǎng)14天的實(shí)驗(yàn)組和常規(guī)組培養(yǎng)細(xì)胞，用含培養(yǎng)基體積10% FBS的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5X106/ml，作為效應(yīng)細(xì)胞。移液器吹打混勻細(xì)胞后各取100 μ 1，5X 15細(xì)胞加至前述96孔板中100 μ I的5X 15靶細(xì)胞中，使效靶比為1: 1，按每ml細(xì)胞懸液加入莫能霉素 0.67 μ I (Protein Transport inhibitor (containing Monensin),BD Pharmingen，美國)，并設(shè)未與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的兩組細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞空白對照，37°C，5%CO2共孵育1.5小時(shí)后，各取混合細(xì)胞lxlO6，PBS洗2次，每管加入APC Mouse Ant1-HumanCD56 檢測抗體 20 μ I, PE Mouse Ant1-Human CD107a 檢測抗體 20 μ I (BD Pharmingen,美國)，室溫孵育30 min, PBS洗2次，通過流式細(xì)胞分析儀測定⑶56+細(xì)胞內(nèi)⑶107a的表達(dá)水平，結(jié)果見圖5和6。
[0080]最終細(xì)胞表達(dá)⑶107a百分?jǐn)?shù)計(jì)算方法=加靶細(xì)胞刺激的⑶107a陽性率(% )_CD107a自發(fā)表達(dá)率(% )
[0081]根據(jù)最終細(xì)胞表達(dá)⑶107a百分?jǐn)?shù)計(jì)算方法，從圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中⑶56+效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)⑶107a的百分?jǐn)?shù)為22.45%，而圖6中常規(guī)組中⑶56+效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)⑶107a的百分?jǐn)?shù)僅為6.32%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)CD107a的細(xì)胞數(shù)是常規(guī)組的3.55倍，說明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)大。
[0082]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟為: 第O天，取外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC，將分離得到的PBMC用第一培養(yǎng)基調(diào)整PBMC濃度為2 X 106/ml,制成PBMC細(xì)胞懸液，然后往PBMC細(xì)胞懸液加入Anti_CD16抗體、IL-2、和IL-15，之后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中于37°C、5% C02、100%濕度條件下開始培養(yǎng)，所述第一培養(yǎng)基為含自體血漿的無血清培養(yǎng)基； 第I天，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入Ant1-CD3抗體，Anti_CD137抗體，在37°C、5% CO2,100%濕度條件下培養(yǎng)； 第3天，往細(xì)胞懸液中半量補(bǔ)加第二培養(yǎng)基，所述第二培養(yǎng)基為含自體血漿、IL-2、IL-15的無血清培養(yǎng)基； 第5天，離心收集細(xì)胞，并用所述第二培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5 X 16/ml，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)裝置中； 繼續(xù)培養(yǎng)和收獲:以后每隔2天取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果往所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置中補(bǔ)充所述第二培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5X106/ml，37°C、5% C02、100%濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)14?21天后，離心收集獲得的⑶3VD56+CIK細(xì)胞和⑶3TD56+NK細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中自體血衆(zhòng)的濃度均為1% -20%體積,優(yōu)選I體積％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和⑶3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述Ant1-CD16抗體的終濃度均為50ng ?lmg/ml,優(yōu)選 500ng/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述IL-2的終濃度均為1000?6000U/mL，優(yōu)選 1000U/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和⑶3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，在所述第一培養(yǎng)基和所述第二培養(yǎng)基中，所述IL-15的終濃度均為lng/ml?100ng/ml,優(yōu)選 20ng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，第I天，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入的所述Ant1-⑶3抗體的終濃度為1ng?lmg/ml,優(yōu)選 50ng/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，第I天，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加入的所述Ant1-⑶137抗體的終濃度為1ng?-1mg/ml,優(yōu)選 500ng/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置是G-REX100L培養(yǎng)裝置。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)高效擴(kuò)增CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3TD56+NK細(xì)胞的方法，其特征在于，在所述繼續(xù)培養(yǎng)和收獲的步驟中，當(dāng)培養(yǎng)體系的總細(xì)胞計(jì)數(shù)不小于5xl09時(shí)，離心收集獲得的CD3+CD56+CIK細(xì)胞和CD3XD56+NK細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104357390SQ201410542830
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】鄔冬云, 楊新娟, 廖嬈君 申請人:深圳源正細(xì)胞醫(yī)療技術(shù)有限公司