一種產(chǎn)表活菌的熒光定量pcr檢測方法
【專利摘要】一種產(chǎn)表活菌的熒光定量PCR檢測方法，涉及油田的微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，先從產(chǎn)出液樣品中提取微生物DNA，并將微生物DNA溶于無菌水中得到DNA溶液；采用引物對樣品中的DNA進行熒光定量PCR擴增，讀取熒光定量PCR擴增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)的檢測值CT；將CT值帶入公式CT=-3.925lgN+40.92，就可計算出產(chǎn)出液樣品中HDR菌濃度值N。本發(fā)明采用特異性引物結(jié)合熒光定量PCR擴增目標(biāo)產(chǎn)表活菌DNA，獲得培養(yǎng)樣品產(chǎn)表活菌的含量。本發(fā)明具有快速檢測、特異性強、操作便捷、檢測準(zhǔn)確的優(yōu)點。
【專利說明】-種產(chǎn)表活菌的熒光定量PCR檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及油田的微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及產(chǎn)表活菌的快速定量檢測方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在原油采出的過程中，原油通過近井地帶向井筒運移，溫度逐漸下降，會造成石蠟 結(jié)晶，石蠟從原油中析出，析出蠟聚集在近井地帶，造成井筒的堵塞，這是引起油井減產(chǎn)的 主要原因。為保證高含蠟油井能夠正常生產(chǎn)，微生物清防蠟技術(shù)是利用解烴菌降解石蠟等 長鏈烷烴的作用，或利用微生物產(chǎn)生的表面活性劑清洗井筒原油，從而達到清蠟的目的。
[0003] 產(chǎn)表活菌在定量分析方面，目前只能通過分子生物學(xué)方法確定其在樣品中的相對 含量(根據(jù)不同微生物克隆數(shù))，并結(jié)合樣品總菌濃(如生物顯微鏡計數(shù)等）進行計算獲得， 由于待測樣品（油井產(chǎn)出液等環(huán)境樣品）一般包含種類繁多、組成復(fù)雜的微生物，而且不同 微生物的豐度相差巨大。在采用傳統(tǒng)方法分析時，一方面，生物顯微鏡計數(shù)誤差較大，且不 能做低濃度檢測；另一方面，對于豐度低的微生物，在DNA提取分析過程中可能會出現(xiàn)漏 檢；對于不同生理特性的微生物，往往因為培養(yǎng)條件不適也會造成漏檢，同時，傳統(tǒng)方法存 在著耗時、過程繁雜等一系列缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種針對性強、操作快捷 簡便的產(chǎn)表活菌的檢測方法。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案包括以下步驟： 1) 從IOOmL產(chǎn)出液樣品中提取微生物DNA，并將微生物DNA溶于無菌水中得到100 μ L 的DNA溶液； 2) 采用引物BS983(F)和BS1315(R)對樣品中的DNA進行熒光定量PCR擴增，讀取熒光 定量PCR擴增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)的檢測值C t ; 3) 將Ct值帶入公式Ct = -3. 9251g N + 40. 92,計算出產(chǎn)出液樣品中HDR菌濃度值N ; 所述引物序列為： BS983(F) ：TAGGACGTCCCCTTCGGGG ； BS1315(R) : CCGACTTCGGGTGTTACAAA。
[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)不足設(shè)計了特異性的一對引物，采用特異性引物結(jié)合熒光定 量PCR擴增目標(biāo)產(chǎn)表活菌DNA，獲得培養(yǎng)樣品產(chǎn)表活菌的含量。本發(fā)明具有快速檢測、特 異性強、操作便捷、檢測準(zhǔn)確的優(yōu)點，對現(xiàn)場油井微生物防蠟技術(shù)的推廣應(yīng)用更具有指導(dǎo)意 義。
[0007] 另外，本發(fā)明所述熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系為：9. 5μ L無菌水、12. 5μ L SYBR Green預(yù)混液、正向引物和反向引物組成各0.5 μ L，及2 μ L產(chǎn)出液樣品DNA。
[0008] 所述突光定量PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)程序是： 1) 95°C保溫 5 min ; 2) 94°C保溫 30 s ; 3) 64°C保溫 30 s ; 4) 72 °C保溫 45 s ; 5) 重復(fù)執(zhí)行2)?4)步驟50次； 6) 從65°C開始每5s增加0. 5°C，直至達到95°C為止； 7) 讀取熒光定量PCR擴增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)的檢測值CT。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為產(chǎn)表活菌樣品的Ct值與IgN的擬合曲線圖。
[0010]

【具體實施方式】
[0011] 一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 1、從100 mL菌濃為1.59X 109 cells/mL的產(chǎn)表活菌樣品中提取DNA，將DNA溶于適量 無菌水中制備得到100 μ L DNA溶液，然后做10倍梯度稀釋，得到不同稀釋度的DNA溶液 樣品。
[0012] 2、設(shè)計出產(chǎn)表活單菌的特異性引物對，其序列為： 正向引物：BS983(F): TAGGACGTCCCCTTCGGGG ;
[0013] 3、采用特異性引物BS983 (F)和BS1315 (R)對獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA進行熒光定量PCR 擴增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下： 熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系：9.5 yL無菌水、12.5 yL Universal SYBRGreen Master Mix (SYBR Green預(yù)混液)、12·5 μΜ的正向和反向引物各0.5 yL，以及2 yL樣 品 DNA。
[0014] 熒光定量PCR擴增的反應(yīng)步驟：a) 95°C保溫5min ;b) 94°C保溫30s ;c) 64°C保溫 30s ;d)72°C保溫45s ;e)循環(huán)重復(fù)執(zhí)行步驟b)?d)50次；f )從65°C開始每5s增加0. 5°C 至達到95°C為止；g)讀取熒光定量PCR擴增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)。
[0015] 4、表1為以上試驗取得的數(shù)據(jù)： 表1

【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)表活菌的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 從IOOmL產(chǎn)出液樣品中提取微生物DNA，并將微生物DNA溶于無菌水中得到100 ii L 的DNA溶液； 2) 采用引物BS983 (F)和BS1315 (R)對產(chǎn)出液樣品中的DNA進行熒光定量PCR擴增，讀 取熒光定量PCR擴增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)的檢測值Ct ; 3) 將Ct值帶入公式Ct= -3. 9251g N + 40. 92,計算出產(chǎn)出液樣品中HDR菌濃度值N ; 所述引物序列為： BS983(F) ：TAGGACGTCCCCTTCGGGG ； BS1315(R) : CCGACTTCGGGTGTTACAAA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述PCR檢測方法，其特征在于所述熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系為： 9.5111無菌水、12.51113￥81?6代611預(yù)混液、正向引物和反向引物組成各0.5 111，及2 111 產(chǎn)出液樣品DNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述PCR檢測方法，其特征在于所述熒光定量PCR擴增反應(yīng)的 反應(yīng)程序是： 1) 95°C 保溫 5 min ; 2) 94°C保溫 30 s ; 3) 64°C保溫 30 s ; 4) 72 °C保溫 45 s ; 5) 重復(fù)執(zhí)行2)?4)步驟50次； 6) 從65°C開始每5s增加0. 5°C，直至達到95°C為止； 7) 讀取熒光定量PCR擴增反應(yīng)初始循環(huán)數(shù)的檢測值CT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313178SQ201410691028
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】楊帆, 時維才, 孟章進, 王彪, 吳偉林, 雷世華 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司