一種用于檢測tbtv和tvdv的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種用于檢測TBTV和TVDV的試劑盒，所述試劑盒包括盒體、盒蓋和設置在盒體內的襯墊，所述襯墊上設有小孔，裝有TBTVdF引物的試劑管、裝有TVDVdF引物的試劑管、裝有TBTVdR引物的試劑管、裝有TVDVdR引物的試劑管、裝有CTAB緩沖液的試劑管、裝有PCR擴增試劑的試劑管、裝有瓊脂糖凝膠的試劑管被設置在所述小孔內，盒蓋頂部內側設有檢測對比卡本實用新型在對煙草叢頂病多種病原物復合侵染煙草和傳毒介體昆蟲進行檢測時具有高效、靈敏、特異且低成本的特點，可以準確檢測煙草及傳毒介體昆蟲中是否含有TBTV、TVDV病原物；本實用新型的試劑盒結構簡單、設計合理，方便攜帶、保存，不易受污染。
【專利說明】—種用于檢測TBTV和TVDV的試劑盒

【技術領域】
[0001]本實用新型屬于分子生物學【技術領域】，涉及一種用于檢測TBTV和TVDV的試劑盒。

【背景技術】
[0002]煙草叢頂病(tobacco bushy top disease)于1957年在津巴布韋北部的春克旺里煙區首次發生，此后爆發流行并造成很大損失。煙草叢頂病在我國的云南早有出現，但長期以來由于該病僅為零星發生，未對煙草生產造成重大損失而被忽視，直到1993年在云南保山、大理等地大面積爆發流行后才逐漸受到關注。此后該病在我國云南中西部煙區大規模流行，給部分煙區造成毀滅性損失，發病區域除涉及保山、大理、楚雄3個州市外，昆明、玉溪、紅河、思茅、文山、西雙版納及怒江等州市也有煙草叢頂病零星發生。截止2001年，云南省累計發病面積達51300 hm2，其中8700 hm2絕收，1400 hm2改種，直接經濟損失高達2.1億元，煙草叢頂病已經成為云南省自20世紀90年代以來唯一導致大面積絕產的煙草病害。
[0003]煙草叢頂病由幽影病毒屬的煙草叢頂病毒(TbAacco bushy top virus, TBTV)和黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬的煙草扭脈病毒(TbAacco vein distorting virus, TVDV)復合侵染引起。另外在云南煙草叢頂病的感病煙株中常檢測到一條伴隨TBTV出現且其分子量約為1000 bp的小分子RNA，根據目前的研究推測該小分子RNA為TBTV的衛星RNA，稱其為煙草叢頂病毒類似衛星 RNA (Tobacco bushy top virus satellite-like RNA,Sat-TBTV)0 2010年又從感染煙草叢頂病的植株中檢測到了大小為3.0kbp與煙草叢頂病相關的RNA,第九次國際病毒分類報告中將其命名為TVDVaRNA (Tobacco vein distortingvirus-associated RNA，TVDVaRNA)。TBTV基因組不含編碼外殼蛋白的基因，它可通過摩擦接種傳播，在輔助病毒TVDV的幫助下可通過蚜蟲傳播。目前的研究結果表明，自然條件下表現典型煙草叢頂病癥狀的煙株，都由上述4種病原物復合侵染引起，而云南煙草叢頂病發病區很多未表現癥狀的煙株，也經常能夠檢測到TVDV及TVDVaRNA。迄今，國內外尚無特別有效的植物病毒病防治藥劑，因此除了嚴防蚜蟲的傳播外加強煙株及蚜蟲中煙草叢頂病病原復合體的檢測和監測，對于準確診斷病害和防止病毒病的傳播流行具有重要的現實意義，是生產上對煙草叢頂病進行綜合治理的重要措施之一。
[0004]通常檢測鑒定植物病毒的方法有生物學、電鏡技術、血清學技術和分子生物學技術等。生物學方法操作簡單，但該方法檢測周期長、靈敏度低，還受到季節、環境以及病毒種類等方面的影響，因此很難用于煙草叢頂病病原物復合體的準確診斷。由于TBTV、Sat-TBTV和TVDVaRNA不編碼外殼蛋白，沒有粒體結構，電鏡技術和常規血清學技術無法用于這3種煙草叢頂病病原物的檢測鑒定；電鏡技術僅能觀察到病毒的粒體形態，很難準確鑒定出病毒種類，且設備昂貴，不適合作為TVDV檢測的普通方法。TVDV的基因組能夠編碼外殼蛋白，病毒具有完整的粒體結構，可以用來作為抗原制備抗血清，但由于TVDV的分布局限于韌皮部，且病毒含量較低，不易直接從病株里提純到病毒粒子，因此目前國內外尚無有關TVDV抗血清方面的報道。分子生物學技術，尤其是RT-PCR技術不但操作簡單，而且特異性強、靈敏度高，但普通RT-PCR方法每次只能檢測一種病毒，對于多種病原物復合侵染的情況，則需要針對每種病毒進行單獨檢測，工作量大，成本高，且效率低。
實用新型內容
[0005]為了解決上述技術問題，本實用新型的目的在于提供一種用于檢測TBTV和TVDV的試劑盒，在對煙草叢頂病多種病原物復合侵染煙草和傳毒介體昆蟲進行檢測時具有高效、靈敏、特異且低成本的特點，可以準確檢測煙草及傳毒介體昆蟲中是否含有TBTV、TVDV病原物；本實用新型的試劑盒結構簡單、設計合理，方便攜帶、保存，不易受污染。
[0006]為實現上述目的，本實用新型采取的技術方案是:一種用于檢測TBTV和TVDV的試劑盒，所述試劑盒包括盒體1、盒蓋2和設置在盒體I內的襯墊3，所述襯墊3上設有小孔，裝有TBTVdF引物的試劑管4、裝有TVDVdF引物的試劑管5、裝有TBTVdR引物的試劑管6、裝有TVDVdR引物的試劑管7、裝有CTAB緩沖液的試劑管8、裝有PCR擴增試劑的試劑管
9、裝有瓊脂糖凝膠的試劑管10被設置在所述小孔內，盒蓋2頂部內側設有檢測對比卡11。
[0007]所述襯墊3上設有7個小孔，所述小孔在所述襯墊3上分成兩排平行排列，一排為4個小孔，另外一排為3個小孔。
[0008]其中所述的TBTVdF引物為TBTV的正向引物，引物序列如下:
[0009]TBTVdF: 5，-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3，，
[0010]其中所述的TVDVdF引物為TVDV的正向引物，引物序列如下:
[0011]TVDVdF: 5，-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3，，
[0012]其中所述的TBTVdR引物為TBTV的反向引物，引物序列如下:
[0013]TBTVdR: 5，-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3，，，
[0014]其中所述的TVDVdR引物為TVDV的反向引物，引物序列如下:
[0015]TVDVdR: 5，-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3，，，
[0016]CTAB 緩沖液由質量百分比為 2% CTAB,2% PVP-40, pH 8.0 的 100 mMTris-HCl,
1.4M NaCl,20mM EDTA組成混合液，最后根據混合溶液的體積加入0.2%巰基乙醇、
[0017]PCR擴增試劑為 15 KL,由 0.6 M-L 的 PrimeScript I Step Enzyme Mix、7.5 M-L 的2X1 Step Buffer、各 0.6 μL 的 10 μ M 正反向引物 TBTVdF 和 TBTVdR、各 0.5μL 的 10 μ M 正反向引物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、2.8 μL的ddH20和0.5 μL的RNA模板混合而成。
[0018]瓊脂糖凝膠為1.0%的瓊脂糖凝膠，在配好的凝膠中每100 ml加入5μL Gold View染色劑混勻。
[0019]檢測對比卡11的信息如下:
[0020]

【權利要求】
1.一種用于檢測TBTV和TVDV的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括盒體(I)、盒蓋(2 )和設置在盒體(I)內的襯墊(3 )，所述襯墊(3 )上設有小孔，裝有TBTVdF弓I物的試劑管(4 )、裝有TVDVdF弓丨物的試劑管(5 )、裝有TBTVdR弓丨物的試劑管(6 )、裝有TVDVdR弓丨物的試劑管(7)、裝有CTAB緩沖液的試劑管(8)、裝有PCR擴增試劑的試劑管(9)、裝有瓊脂糖凝膠的試劑管(10)被設置在所述小孔內，盒蓋(2)頂部內側設有檢測對比卡(11)。
2.按照權利要求1所述的一種用于檢測TBTV和TVDV的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(3)上設有7個小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列，一排為4個小孔，另外一排為3個小孔。
【文檔編號】C12Q1/70GK203960211SQ201420345560
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】梁建軍, 楊櫟 申請人:梁建軍