本發明涉及柞蠶蛹提取領域，具體而言，涉及一種柞蠶蛹提取物、規模化生產方法及應用。
背景技術：
昆蟲沒有專門的免疫系統，也沒有產生免疫蛋白的細胞，但是昆蟲先天免疫和后天所獲得的免疫能力卻是驚人的。近年來，對昆蟲防御機制的研究發現，給蓖麻蠶、天蠶、家蠶以及棕尾別麻蠅等昆蟲的幼蟲或者蛹注射非致命細菌、疫苗菌等，都能誘導昆蟲血淋巴產生免疫活性多肽和蛋白，這些蛋白或者多肽具有較強的廣譜殺菌能力。
柞蠶是一種飼養于野外的經濟昆蟲，經常受到各種病毒、細菌以及自然界惡劣環境的侵襲，但柞蠶卻能夠適應十分惡劣的生態環境，并能夠生存和發展。由此可見，柞蠶具有獨特的防御和免疫系統，以及很強的抗病毒和細菌能力。
許多研究已經證實，柞蠶體內的血淋巴中，存在若干種抗病活性物質，但由于這些物質的濃度較低，采用一般的實驗手段難以進行有效提取，因而提取方法大多還僅停留在實驗室研究階段，并沒有出現成熟的、工業規模化的提取生產工藝。
為了解決無法工業規模化提取柞蠶體內有效物質的問題，現有技術中也做出了大量的努力。現有技術(《柞蠶抗病活性物質的提取及應用》，李樹英，中國蠶業，第36期第1卷，第20-24頁)，就公開了一種通過大腸桿菌突變株進行生物誘導，以激發柞蠶防御體質，從而促進生成足量活性物質，并進一步提取的方法。同時，現有技術(“柞蠶蛹發育過程中生理活性物質和蛋白質的變化研究”孟楠等，中國蠶業，第36卷第3期，第24-27頁)，也公開了以柞蠶鏈球菌誘導柞蠶抗菌活性物質，并提取柞蠶活性成分的方法。
然而，雖然這些現有技術中雖然取得了一定的進展，但作為柞蠶提取物工業化生產的前期研究而言，這些方法還是存在較多問題的。例如：(1)現有的提取方法中容易出現干擾，嚴重影響活性物質的質量；(2)以柞蠶鏈球菌和大腸桿菌為誘導劑所進行的提取反應獲得的成品收率低；(3)大腸桿菌和柞蠶鏈球菌都不屬于可食用菌，在功能性食品及藥品生產應用中存在風險。
有鑒于此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的第一目的在于提供一種柞蠶蛹提取物規模化生產方法，本發明方法中，以可食用菌為誘導劑，因此所得到的提取物安全性高；同時，本發明方法提取物總收率高，適宜工業規模化生產；進一步的，本發明方法對于不同活性成分含量的提升也有所側重，能夠滿足不同的生產需求。本發明方法具有安全高效、產率高，適于規模化生產等優點。
本發明的第二目的在于提供一種由本發明方法提取得到的柞蠶蛹提取物。本發明柞蠶蛹提取物以可食用菌進行誘導并提取得到，因此具有提取物安全性高等優點。
本發明的第三個目的在于提供一種所述柞蠶蛹提取物的應用。本發明柞蠶蛹提取物安全性好，且有效成分含量高，因此適于作為原料以制備用于疾病治療的藥物或者保健食品。
為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
一種柞蠶蛹提取物規模化生產方法，所述方法包括如下步驟：將處于滯育期的柞蠶蛹儲存后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，并培養；采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物；
其中，所述菌液為PZ4或者PZ5中的一種或兩種的混合物；
PZ4為乳酸乳球菌乳脂亞種，生物保藏號為CGMCC 1.3992；PZ5為乳酸乳球菌亞種，生物保藏號為CGMCC 1.2829。
本發明中，通過使用乳酸乳球菌乳脂亞種以及乳酸乳球菌亞種等可食用菌種作為誘導劑，從而可以使得進一步提取所得到的提取物具有很好的安全性，并適于作為原料以制備相應的藥物；同時，本發明以可食用菌種進行誘導，也可以獲得較高的產率，還能夠在一定程度上控制提取物中不同活性物質的含量，因而適于工業化的規模生產，也適于對產品中活性物質要求有所不同的大規模生產中。
可選的，本發明中，可以通過控制光照的方法進行解除滯育。
可選的，本發明中，所述儲存為將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d；例如，本發明中，可以將處于滯育期的柞蠶蛹在1、2或者3℃的條件下，儲存15、30、45、50、55、60或者65d。
本發明中，通過對待提取的滯育期柞蠶蛹儲存溫度和儲存時間的選擇和調整，從而可以使得本發明中待提取柞蠶蛹具有良好的生物活性，并利于進一步生物細菌刺激以及活性成分的高效提取。
可選的，本發明中，所述注射處理為每個柞蠶蛹注射40～60μL菌液，菌液濃度為1×105～1×108cells/ml；例如，本發明中，每個柞蠶蛹可以注射45、50或者55μL菌液，菌液的濃度可以為1×106或者1×107cells/ml等。
本發明中，通過對用以誘導的菌液用量及濃度的選擇和調整，從而可以對柞蠶蛹進行有效的生物刺激。
可選的，本發明中，所述培養為將注射處理后的柞蠶蛹在18～24℃條件下，培養3～7d；例如，本發明中，注射處理后的柞蠶蛹可以在19、20、21、22或者23℃條件下，處理4、5或者6d。
可選的，本發明中，所述采集培養后柞蠶蛹的血淋巴為在冰浴條件下采集血淋巴。
本發明中，通過在冰浴條件下采集血淋巴，從而可以有效保持提取物中效物質的活性。
可選的，本發明中，所述冷凍干燥的時間為12～24h；例如，本發明所述冷凍干燥的時間可以為，但不限于13、15、17、20、22或者23h等。
本發明中，通過對冷凍干燥時間的選擇和調整，從而可以在對提取物有效干燥純化的同時，還能夠避免冷凍干燥時間過長所導致的整體制備效率的降低以及對活性成分的結構破壞。
可選的，本發明中，所述方法還進一步包括將柞蠶蛹提取物消毒的步驟。
本發明中，通過進一步在提取后增加消毒的步驟，從而能夠進一步提高本發明柞蠶蛹提取物的安全性。
可選的，本發明中，所述消毒為Co60輻照消毒。
進一步的，本發明提取方法步驟如下：
將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，每只柞蠶蛹注射40～60μL濃度為1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃條件下，培養3～7d；在冰浴條件下，采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥為12～24h，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物，然后將所得柞蠶蛹提取物進行Co60輻照消毒；
其中，所述菌液為PZ4或者PZ5中的一種或兩種的混合物；
進一步的，PZ4為乳酸乳球菌乳脂亞種，生物保藏號為CGMCC 1.3992；PZ5為乳酸乳球菌亞種，生物保藏號為CGMCC 1.2829。
一種柞蠶蛹提取物，所述提取物是由本發明所述方法提取得到的。
本發明中，通過以本發明所述方法提取得到柞蠶蛹提取物，因此提取得到的柞蠶蛹提取物安全性高，適于作為制備藥物及保健食品用原料。
本發明所述柞蠶蛹提取物在制備治療疾病藥物或保健食品中的應用。
本發明柞蠶蛹提取物中有效成分含量高，且安全性好，因而適于作為藥物制備所用原料而用于制備疾病治療或者保健藥物中。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：
(1)本發明以可食用菌為誘導劑，因此所得到的提取物安全性高；同時，本發明方法提取物總收率高，適宜工業規模化生產，還能夠滿足不同的生產需求；
(2)本發明方法中，通過對各步驟條件的進一步調整和優化，從而進一步提高了本發明的提取效率；
(3)本發明柞蠶蛹提取物安全性好，適于作為制備藥物以及保健食品所用原料。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
實施例1
將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，每只柞蠶蛹注射40～60μL濃度為1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃條件下，培養3～7d；在冰浴條件下，采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥為12～24h，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物，然后將所得柞蠶蛹提取物進行Co60輻照消毒；
其中，所述菌液為PZ4；
進一步的，PZ4為乳酸乳球菌乳脂亞種，生物保藏號為CGMCC 1.3992；
實施例1方法柞蠶蛹提取物的收率為2.5％。
實施例2
將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，每只柞蠶蛹注射40～60μL濃度為1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃條件下，培養3～7d；在冰浴條件下，采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥為12～24h，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物，然后將所得柞蠶蛹提取物進行Co60輻照消毒；
其中，所述菌液為PZ5；
進一步的，PPZ5為乳酸乳球菌亞種，生物保藏號為CGMCC 1.2829；
實施例2方法柞蠶蛹提取物的收率為2.6％。
實施例3
將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，每只柞蠶蛹注射40～60μL濃度為1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃條件下，培養3～7d；在冰浴條件下，采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥為12～24h，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物，然后將所得柞蠶蛹提取物進行Co60輻照消毒；
其中，所述菌液為PZ4以及PZ5的混合物；
進一步的，PZ4為乳酸乳球菌乳脂亞種，生物保藏號為CGMCC 1.3992；PZ5為乳酸乳球菌亞種，生物保藏號為CGMCC 1.2829；
實施例3方法柞蠶蛹提取物的收率為2.3％。
對比例1
將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，每只柞蠶蛹注射40～60μL濃度為1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃條件下，培養3～7d；在冰浴條件下，采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥為12～24h，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物，然后將所得柞蠶蛹提取物進行Co60輻照消毒；
其中，所述菌液為大腸桿菌E.eoliKl2D31；
進一步的，對比例1方法柞蠶蛹提取物的收率為0.5％。
對比例2
將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，每只柞蠶蛹注射40～60μL濃度為1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃條件下，培養3～7d；在冰浴條件下，采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥為12～24h，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物，然后將所得柞蠶蛹提取物進行Co60輻照消毒；
其中，所述菌液為柞蠶鏈球菌(1010)；
進一步的，對比例2方法柞蠶蛹提取物的收率為2.2％。
對比例3
將處于滯育期的柞蠶蛹在0～4℃條件下，儲存10～70d后取出，并解除滯育；然后，用菌液對柞蠶蛹進行注射處理，每只柞蠶蛹注射40～60μL濃度為1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃條件下，培養3～7d；在冰浴條件下，采集培養后柞蠶蛹的血淋巴，冷凍干燥為12～24h，并粉碎，即得柞蠶蛹提取物，然后將所得柞蠶蛹提取物進行Co60輻照消毒；
其中，所述菌液為柞蠶鏈球菌(1212)；
進一步的，對比例3方法柞蠶蛹提取物的收率為2.0％。
實驗例1
進一步的，分別取等量實施例1-3以及對比例1-3所制得的柞蠶蛹提取物，并分別測試不同組柞蠶蛹提取物中柞蠶抗菌肽以及柞蠶溶菌酶等活性物質的含量，檢測步驟具體如下：
(一)抗菌肽的活性檢測
1.材料
(1)細菌菌株大腸桿菌(E colikl2D31)。
(2)玻璃培養皿(直徑7.5cm)滅菌備用。
(3)打孔器外直徑2.7mm。
2.試劑的配制
(1)LB液體培養基
用5moL/L NaOH調pH至7.4，121℃高壓滅菌20min，備用。
(2)E+B緩沖液(50×)
加50ml蒸餾水溶解，定容至lO0ml，121℃高壓滅菌20min。
(3)液體應用培養基
(4)LB固體培養基:
LB液體培養基 10ml
Agar l.0g
121℃高壓滅菌20min。
3.樣品的處理
在冰浴下采取誘導蛹血淋巴(血淋巴凍干物按1:10，溶于生理鹽水)，然后置100℃水浴中加熱5min，取上清液于3 000r/min離心5min，取離心上清液為供試樣品。
4.抗菌活性測定
(1)大腸桿菌菌液的制備
用接種環挑取E.coliKl2D31斜面菌種接種于液體應用培養基中，37℃靜止培養l6h。從中吸取0.2ml培養菌液再轉接于新鮮的5ml液體應用培養基中，37℃振蕩培養4～6h，使每毫升菌液約含大腸桿菌l06個左右。
(2)檢測平板的制備
將lO0ml LB固體培養基溶化后降溫至55℃，按終濃度2％加E+B緩沖液(50×)、1.0％葡萄糖溶液(20％)、0.1％硫酸鏈霉素(250 000U/ml，充分混勻后加人大腸桿菌菌液50μl。迅速振蕩充分混勻后，傾人玻璃培養皿內，6.5ml/皿，水平放置，凝固后4℃保存備用。
(3)活力測定
用打孔器在檢測平板上打出直徑2.7mm的小圓孔，并標示待測樣品、對照樣品編號。分別吸取待測樣品和對照品各5μl，按編號逐一注入小孔中，每個樣品都設3個重復。每塊平板上都帶有對照品作為內控。蓋好皿蓋，靜置l0min后倒置于37℃恒溫箱中培養12～18h，可見清晰的抑菌圈。用游標尺測量其直徑，分別記錄待測樣品和對照品的抑菌圈直徑。
(二)柞蠶蛹溶菌酶活力測定方法
用Beckman DU-7型分光光度計測定并自動記錄與掃描。具體方法如下:
1.底物的調制
用0.1moL/L，pH6.2磷酸鹽緩沖液將溶壁微球菌菌體調制成0.72 0D450nm的懸濁液，置于l8％～20％水浴中，隨配隨用。
2.溶菌酶標準液的調制
精確稱取溶菌酶制劑，溶解于0.1mol/L、pH6.2磷酸鹽緩沖液中，使成為lmg/ml的母液，隨即吸取0.1ml注入預先盛0.9ml緩沖液的小離心管中，用時再稀釋25倍，便成4mg/ml的標準液。
3.測定步驟
將2.5ml底物懸濁液移入比色杯中(1cm直徑)，恒溫18～20℃，加入標準溶菌酶液O.5ml，充分混合lmin，立即用分光光度計自動記錄和掃描450nm OD值的變化。連續記錄3min。在平均每分鐘下降0.02～O.040D值的情況下，反應時間與OD值下降呈線性關系。
4.溶菌酶活力單位計算
20℃，每分鐘使450nm波長消化值減少0.0010D的酶量為一個活性單位。實驗證明空白消光值⊿A0為0。試樣消光值,⊿A/min系指作用時間l～3min的平均濃度下降值，具體計算公式如下：
柞蠶蛹提取物活性物質含量檢測結果如下所示：
由上述檢測結果可知，由本發明提取得到的柞蠶蛹提取物明顯活性物質含量更高。
本發明以可食用菌為誘導劑誘導柞蠶蛹產生活性物質，并進一步將誘導所得活性物質進行提取，因此所得到的提取物安全性高，并能夠作為藥物及保健食品生產的原料；同時，本發明方法提取物總收率高，適宜工業規模化生產，還能夠滿足不同的生產需求。
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。