本發明屬于畜牧業動物營養技術研究領域，涉及一種以丁酸梭菌為飼料添加劑的飼料配方，更具體的說是一種改善斷奶仔豬腸道屏障功能、調節細胞因子含量、D-乳酸（D-lactic）和二胺氧化酶（DAO）等方面的應用。
背景技術：
腸道是食物在體內消化吸收的主要場所，同時也是重要的免疫器官。腸道處在機體與外界接觸的第一線，是病原微生物侵入體內的主要通道，腸粘膜屏障是組織機體受病原微生物的感染，調節新陳代謝，維持內外環境平衡的關鍵。機械屏障是一種重要的腸黏膜屏障，由腸道上皮細胞和細胞間緊密連接等構成，而腸上皮細胞的機械屏障是黏膜屏障基礎，緊密連接蛋白在加強細胞間連接，減小細胞間間隙，保護細胞和黏膜完整性中具有重要作用。腸黏膜屏障能夠阻止消化道內有害大分子入侵，保證機體選擇性吸收小分子物質。因此，腸黏膜屏障在維持腸道正常生理功能方面起著關鍵作用。
抗生素類生長促進劑在飼料工業中的大量使用導致諸多問題出現，如病原菌產生耐藥性、動物免疫機能下降、體內菌群失調、畜禽產品中的藥物殘留等。近年來，畜牧業養殖在保障動物健康、促進動物生長、提高飼料利用率等方面越來越得到重視，飼料添加劑的研究正在向著無殘留、無耐藥性和對人類健康和環境無危害的方向發展。丁酸梭菌具有耐熱、耐酸和耐多種抗生素等生物學特性，可調節腸道微生態平衡、產生益生物質、提高機體免疫力及促進動物生長，同時具有無污染、無有害殘留等特點，逐漸成為熱門的抗生素替代品之一。雖然我國農業部已于2009年7月批準了丁酸梭菌制劑作為微生物飼料添加劑的使用，但目前丁酸梭菌制劑還未被普遍的作為益生菌劑添加于動物飼料，而在仔豬上應用的相關報道還不多見。
仔豬斷奶是養豬生產中的一個重要階段，斷奶應激是仔豬出生后經受的最大應激，由于生理、飼料和環境的改變常常造成仔豬腸消化系統損傷及菌群失衡等，因此仔豬腸道健康的營養調控這一領域的創新性有待于提高。通過在日糧中添加丁酸梭菌我們研究了一種調節改善仔豬腸道屏障功能的配合飼料，以此來改善仔豬腸道發育和健康的營養調控，會在一定程度上提高養殖業的經濟效益。
技術實現要素：
本發明的一個目的是公開了一種調節仔豬腸道屏障功能的配合飼料。
本發明的另一個目的是公開了所配制的飼料對斷奶仔豬腸道屏障功能調節的應用效果。
為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容
一種調節仔豬腸道屏障功能的配合飼料，其特征在于在飼料原料中使用丁酸梭菌飼料添加劑，進行合理配制日糧，由下述重量份數的原料組成：
玉米61—65 豆粕15—20 乳清粉3—6
魚粉5—10 葡萄糖1-3 酸化劑0.1-0.5
磷酸氫鈣0.5-1 石粉0.5-1 食鹽0.1-0.5
L-賴氨酸鹽酸鹽0.1-0.5 DL-蛋氨酸0.1-0.5 蘇氨酸0.1-0.5
仔豬預混料1-4 丁酸梭菌0.001-0.01（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發明所述酸化劑指的是安徽華揚農牧科技有限公司產品，主要成分是乳酸、正磷酸、檸檬酸、富馬酸、甲酸。
本發明所述的斷奶仔豬配合飼料的制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進行稱量，在小型混合機中混勻即可。
本發明一個優選的配方：
玉米63.2豆粕19乳清粉4.8
魚粉8.4葡萄糖1酸化劑0.3
磷酸氫鈣0.6 石粉0.7食鹽0.3
L-賴氨酸鹽酸鹽0.3 DL-蛋氨酸0.1蘇氨酸0.1
仔豬預混料1 丁酸梭菌0.005（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）；
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發明另一個優選的配方：
玉米64.1豆粕18.5乳清粉4.9
魚粉7.2葡萄糖2 酸化劑0.3
磷酸氫鈣0.6石粉0.7 食鹽0.3
L-賴氨酸鹽酸鹽0.1 DL-蛋氨酸0.1蘇氨酸0.1
仔豬預混料1 丁酸梭菌0.006（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）；
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發明進一步公開了所配制的飼料對斷奶仔豬腸道微生物區系的應用效果。特別是對改善斷奶仔豬腸道黏膜發育等方面的應用。本發明的斷奶仔豬配合飼料實驗結果表明：
日糧中添加丁酸梭菌后，顯著提高了緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達，顯著提高了血清中TNF-α和IL-10的分泌量，顯著降低了血清中D-lactin的濃度，血清中DAO的濃度也有下降趨勢，表明該飼料配方能有效提高仔豬腸道屏障功能。
為了更進一步說明本發明的積極效果，提供如下的試驗方法及結果：
1．試驗動物及分組：
采用單因子試驗設計，選取體重6.95 ± 0.48 kg的健康杜×長×大三元雜交斷奶仔豬12頭，隨機分為2個處理，每個處理分為6個重復，每個重復1頭豬。每個處理組分別飼喂不同日糧：飼喂基礎日糧(NC)、飼喂基礎日糧+0.005%丁酸梭菌（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g，試驗組）。丁酸梭菌為市售產品。
2．基礎飼糧配方及營養水平：
根據NRC（1998）配制豬基礎日糧配方及營養水平如表1所示。
表1 基礎飼糧組成及營養水平（飼喂基礎）
a 每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
b 根據NRC（1998）飼料成分表計算。
3．試驗規程：
試驗在一個商品萬頭豬場進行，試驗期14天。飼喂、管理、免疫按豬場規定程序進行。飼喂14天后，從每個處理的每個重復組中隨機選取1頭斷奶仔豬屠宰，屠宰前抽血，進行血液指標的分析，每個處理屠宰3頭仔豬，并取空腸腸段進行緊密連接蛋白表達量的測定。整個試驗過程中觀察仔豬的健康狀況，記錄死、淘仔豬以及腹瀉、用藥情況。
4．測定指標：
血液指標的測定：每個處理隨機選3頭仔豬，屠宰前30min，前腔靜脈采血，4℃，4000g，15min離心，取上清，-20℃保存。采用生化法測定DAO，采用ELISA法測定TNF-α、IL-10和D-lactic。空腸中緊密連接蛋白表達的測定：采血后處死，立即在無菌條件下打開腹腔，從空腸中段取5cm左右腸管，用PBS沖洗腸腔后分裝于凍存管中，分別標號后即置于液氮中保存，用qPCR檢測Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達。
5．統計分析：
采用SAS統計軟件下的Compare Means模塊中的One-Way ANOVA進行方差分析，并采用Duncan’s多重比較進行組間差異顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著。
本發明公開的調節仔豬腸道黏膜的配合飼料在斷奶仔豬飼料中的應用效果，主要包括：
（1）血清指標：
由表2可知，丁酸梭菌：試驗組顯著提高了血液中TNF-α和IL-10的含量（P<0.05），分別比對照組提高了34.25%和27.23%，顯著降低了血液中D-lactic的濃度（P<0.05），比對照組降低了19.57%，DAO的濃度比對照組降低了13.07%。
表2 對仔豬血液指標的影響
（2）腸粘膜屏障：
由表3可知，緊密連接蛋白mRNA水平表達：試驗組的Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達量顯著高于對照組（P＜0.01），試驗組中的Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達量比對照組分別提高了59.00%、107.00%、59.00%。
表3 對腸道連接蛋白mRNA表達的影響
試驗結果表明：
日糧中添加丁酸梭菌后，顯著提高了顯著提高了Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA水平的表達量，表明該飼料配方能有效提高仔豬腸道屏障功能；
本發明對以丁酸梭菌為飼料添加劑的飼料配方進行了安全性實驗，其方法如下：
（1）步驟：
材料和方法：選擇28日齡斷奶的杜×長×大仔豬6頭，臨床健康、發育正常，試驗期30天，試驗期內隨時觀察中毒表現及死亡情況。
（2）飼喂的仔豬飼料原料組成：
玉米63.55、豆粕19.5、乳清粉4、魚粉7.4、葡萄糖2、酸化劑0.3、磷酸氫鈣0.5、石粉0.6、食鹽0.35、L-賴氨酸鹽酸鹽0.2、DL-蛋氨酸0.25、蘇氨酸0.15、仔豬預混料1.1、丁酸梭菌0.01（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。
結果：給斷奶仔豬飼喂上述試驗日糧，連續飼喂30天，未見明顯中毒現象，觀察期內無死亡，尸檢中各主要臟器未見明顯異常。
（3）結論：斷奶仔豬日糧中添加0.01%丁酸梭菌（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）飼喂仔豬，飼喂效果安全。
具體實施方式
通過以下實施例對本發明作一步說明，但不作為本發明的限制。本發明的實施例中所述的重量份數原料指的是克、公斤或噸，可根據生產實際的需要加以調整。本發明所用到的各種原料例如：磷酸氫鈣、石粉、食鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、DL-蛋氨酸、蘇氨酸、丁酸梭菌對外均有售；其中下面的產品均有市售：
酸化劑指的是安徽華揚農牧科技有限公司產品；
1%仔豬預混料購買于北京博農利生物科技有限公司；
玉米指的是普通市售二級玉米；
豆粕指的是中糧集團有限公司產品；
乳清粉指的是天津市升騰飼料有限公司產品；
魚粉指的是進口秘魯魚粉；
豆奶寶指的是天津市新概念生物技術有限公司產品；
次粉指的是河北永生食品有限公司產品；
葡萄糖指的是天津市升騰飼料有限公司產品；
丁酸梭菌指的是洛陽瑞萊生物工程有限公司產品。
實施例1
斷奶仔豬的配合飼料原料組成：
玉米62.48、豆粕18.5、乳清粉5、魚粉8.5、葡萄糖1.5、酸化劑0.2、磷酸氫鈣0.7、石粉0.63、食鹽0.34、L-賴氨酸鹽酸鹽0.25、DL-蛋氨酸0.3、蘇氨酸0.3、仔豬預混料1.2、丁酸梭菌0.001（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進行稱量，在小型混合機中混勻即可。
實施例2
斷奶仔豬的配合飼料原料組成：
玉米64.9、豆粕16、乳清粉5、魚粉8.6、葡萄糖1.5、酸化劑0.4、磷酸氫鈣0.65、石粉0.7、食鹽0.35、L-賴氨酸鹽酸鹽0.3、DL-蛋氨酸0.25、蘇氨酸0.25、仔豬預混料1、丁酸梭菌0.01（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進行稱量，在小型混合機中混勻即可。
實施例3
采用斷奶仔豬的配合飼料飼喂斷奶仔豬的方法：
此系列配方適用28日齡斷奶仔豬，適用期為斷奶后30~45天，根據情況讓仔豬自由采食即可，必須提供充足的飲水，其他按正常的飼養管理進行。
實施例4
比較試驗
常規的斷奶仔豬飼料：
方法：配制玉米-豆粕型斷奶仔豬日糧，不添加丁酸梭菌。選擇28日齡6頭仔豬，試驗期14天。試驗結束后對3頭仔豬進行屠宰，采血、取空腸腸段。
步驟：采用生化法和ELISA試劑盒測定血液指標，qPCR測定Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達。
結果：血清中D-lactin和DAO的濃度分別為2.15 mmol/L、3.75 mmol/L，TNF-α和IL-10的含量分別為41.42ng/L和58.91ng/L。Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA水平表達量分別為0.96、0.99、0.97。
日糧中添加含丁酸梭菌后飼料：
方法：配制玉米-豆粕型斷奶仔豬日糧，添加0.005%丁酸梭菌（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。選擇6頭28日齡仔豬，試驗期14天。試驗結束后隨機選3頭仔豬進行采血、取空腸腸段。
步驟：采用生化法測定DAO，采用ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-10和D-lactic。采用qPCR測定Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達。
結果：血清中D-lactin和DAO的濃度分別為1.67mmol/L、3.26mmol/L，TNF-α和IL-10的含量分別為77.16 ng/L和64.59 ng/L。Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達分別為1.55、2.03、1.41。
結論：日糧中添加丁酸梭菌能提高仔豬腸道屏障功能。通過比較試驗說明：日糧中添加丁酸梭菌能調節斷奶仔豬腸道屏障功能，改善腸道健康和提高仔豬整體健康狀況。