本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種衣藻乙醇提取物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微藻是一類于海洋、湖泊、河流等水體環(huán)境中獨(dú)立存在或成鏈狀、團(tuán)狀存在的單細(xì)胞微觀藻類。微藻具有極大的生物多樣性，分布十分廣泛，地球上大約存在200000～800000種不同門類的微藻，其中約35000種已有描述，超過15000種從藻類生物物質(zhì)中產(chǎn)生的新型化合物已進(jìn)行化學(xué)鑒定。

微藻具有分布廣且不占用耕地、生物量大、光合效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、油脂含量高和環(huán)境友好等特點(diǎn)，因此在生物柴油的開發(fā)中得到重視，目前大部分微藻的應(yīng)用和研究都主要集中在高效產(chǎn)油方面。此外，由于微藻營(yíng)養(yǎng)豐富，富含微量元素和各類生物活性物質(zhì)，因此，其在醫(yī)藥、保健品、化妝品、水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料和飼料添加劑等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前微藻在醫(yī)藥、保健品方面的應(yīng)用研究較少，且這些方面的研究目前主要集中在螺旋藻、小球藻、鹽生杜氏藻和紫球藻等幾種常見的微藻，對(duì)于其他微藻則相對(duì)報(bào)道較少。

衣藻屬綠藻門綠藻綱團(tuán)藻目衣藻科衣藻屬，藻體為單細(xì)胞，球形或卵形，前端有兩條等長(zhǎng)的鞭毛，能游動(dòng)。衣藻素有“綠色酵母”之稱，與酵母有許多共同之處，如生長(zhǎng)周期簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)快，世代時(shí)間短，可以在平板上形成單克隆，也能進(jìn)行液體培養(yǎng)，以單倍體與二倍體兩種形式生長(zhǎng)，能對(duì)其配子的發(fā)育過程進(jìn)行四分子分析。衣藻的獨(dú)特之處在于其在光照和黑暗條件下均能生長(zhǎng)，且能把外界提供的碳源與光合成的碳物質(zhì)分開，是目前惟一能特異地對(duì)線粒體、葉綠體與核分別建立轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的生物。目前對(duì)衣藻的研究主要集中在生物產(chǎn)油和生物制氫方面，對(duì)其抗氧化方面的生物活性研究則鮮有報(bào)道。因此積極開發(fā)具有抗氧化、抗衰老作用的衣藻提取物將對(duì)衰老相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種衣藻乙醇提取物。本發(fā)明提供的衣藻乙醇提取物能夠顯著延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活時(shí)間和延長(zhǎng)自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，同時(shí)，其能促進(jìn)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)的水平，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明的技術(shù)方案將通過下面的詳細(xì)描述來進(jìn)一步體現(xiàn)和說明。

一種衣藻乙醇提取物，其制備方法包括如下步驟：

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融3～5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)為70％～99％的乙醇超聲提取2～4次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，即得衣藻乙醇提取物。

優(yōu)選地，步驟s2中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入乙醇進(jìn)行超聲提取。

優(yōu)選地，步驟s2中超聲提取的頻率為35～40khz，溫度為4℃。

優(yōu)選地，步驟s2中每次超聲提取的時(shí)間為10～30min。

本發(fā)明所述衣藻(chlamydomonassp.)由中國科學(xué)院水生生物研究所提供，其在中國科學(xué)院淡水藻種庫中的編號(hào)為fachb-889。

本發(fā)明人在對(duì)微藻進(jìn)行研究的過程中，進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)對(duì)反復(fù)凍融，離心取上清后剩余的殘?jiān)M(jìn)行乙醇超聲提取制得到的衣藻乙醇提取物能夠顯著延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活時(shí)間和延長(zhǎng)自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，同時(shí)，其能促進(jìn)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)的水平，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明衣藻乙醇提取物可單獨(dú)或與其他活性成分合用，作為唯一或主要活性成分應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能功能的保健食品和藥品，所述保健食品和藥品的劑型優(yōu)選為片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。

本發(fā)明所述的抗氧化、抗衰老作用是指對(duì)以病理或生理?xiàng)l件下因發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的變化為主要特征的衰老及衰老相關(guān)疾病的防治作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)在整體動(dòng)物水平上以氧化應(yīng)激模型及衰老相關(guān)模型進(jìn)行試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的衣藻乙醇提取物可以顯著延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率，同時(shí)還可以延長(zhǎng)自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，具有顯著的抗衰老和抗氧化作用。

(2)本發(fā)明提供的衣藻乙醇提取物能促進(jìn)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)水平，具有顯著的抗氧化作用。

(3)本發(fā)明提供的衣藻乙醇提取物的制備方法具有周期短，有機(jī)溶劑消耗少，工藝簡(jiǎn)單，安全無毒，穩(wěn)定高效等特點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1衣藻乙醇提取物對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖2衣藻乙醇提取物對(duì)自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響。

圖3衣藻乙醇提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

本發(fā)明實(shí)施例中，衣藻由中國科學(xué)院水生生物研究所提供，其在中國科學(xué)院淡水藻種庫中的編號(hào)為fachb-889。

sbasal溶液：稱取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于試劑瓶中，加入750ml去離子水，完全溶解后定容至1l，滅菌30min，冷卻至40-50℃?zhèn)溆谩?/p>

smedium溶液：取1l滅菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml膽固醇乙醇溶液，邊加變振搖，使其充分溶解(溶液由無色透明轉(zhuǎn)為微乳白透明，無明顯沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m檸檬酸鉀溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常溫放置備用。

實(shí)施例1衣藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融4次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為25min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，調(diào)節(jié)其相對(duì)于衣藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示衣藻濕藻)，即得衣藻乙醇提取物。

實(shí)施例2衣藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-20℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為35khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為30min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，調(diào)節(jié)其相對(duì)于衣藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示衣藻濕藻)，即得衣藻乙醇提取物。

實(shí)施例3衣藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融4次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為90％的乙醇超聲提取2次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為20min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，調(diào)節(jié)其相對(duì)于衣藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示衣藻濕藻)，即得衣藻乙醇提取物。

實(shí)施例4衣藻乙醇提取物對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

百草枯，學(xué)名甲基紫精，是一種強(qiáng)氧化劑，可誘導(dǎo)體內(nèi)大量產(chǎn)生活性氧自由基(ros)，使機(jī)體處于氧化脅迫環(huán)境，進(jìn)而出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。

取實(shí)施例1制得的衣藻乙醇提取物，按終濃度100mga/ml加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)(由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)秀麗隱桿線蟲遺傳信息保藏中心提供)中，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果顯示，衣藻乙醇提取物能夠延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的衣藻乙醇提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實(shí)施例5衣藻乙醇提取物對(duì)自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響

向同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中加入終濃度為100mga/ml的實(shí)施例1制備的衣藻乙醇提取物，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)，然后每隔1天統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲的存活情況，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的壽命以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示。

圖2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，衣藻乙醇提取物相能夠延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的平均壽命。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的衣藻乙醇提取物具有延緩衰老進(jìn)程的作用。

實(shí)施例6衣藻乙醇提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)孔，每孔終體積為1ml，試驗(yàn)組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實(shí)施例1制得的衣藻乙醇提取物，衣藻乙醇提取物的終濃度100mga/ml，對(duì)照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗(yàn)組衣藻乙醇提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針(購于sigma公司，cas號(hào)：2044-85-1)溶液，利用熒光酶標(biāo)儀在485nm激發(fā)波長(zhǎng)和538nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，室溫檢測(cè)2h，每10min測(cè)一次。結(jié)果用f檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)衣藻乙醇提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平顯著下降。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的衣藻乙醇提取物能夠促進(jìn)體內(nèi)ros的清除，顯著降低體內(nèi)ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。