專利名稱：產蛋白酶的菌株、制備蛋白酶液的方法及使用該酶液于改善低次等煙葉品質的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株產蛋白酶的細菌菌株、制備蛋白酶液方法及使用其蛋白酶液改善低次等煙葉品質，具體地說是利用來自煙葉上的優勢菌株發酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質的方法。
背景技術：
我國是烤煙生產和消費大國，烤煙生產在煙草的發展中占據重要地位。目前我國煙葉質量與生產水平同國際先進水平相比，仍然有較大差距，還遠不能滿足提高國內卷煙質量和擴大出口的需要。提高煙葉品質和可用性直接關系到我國煙草行業持續、穩定、健康發展，也是增強我國煙葉國際市場競爭力的必由之路。由于煙的品種、種植和烘烤等原因，我國烤煙蛋白質、淀粉等大分子物質含量往往 偏高。蛋白質含量與煙葉品質優劣存在緊密相關性，蛋白質含量過高，不僅會降低煙制品的燃燒性，而且有似燒焦羽毛的臭味，同時伴有辛辣、苦澀的感覺。此外會使煙氣中有害成分如HCN等含量增加，嚴重影響煙葉的香味品質和吸食安全性。另一方面煙葉蛋白質水解產物可以進一步轉化生成有利于煙葉品質的致香物質。因此，降低煙葉中蛋白質含量對改善煙葉品質、提高煙葉可用性和吸食安全性極為重要。在蛋白酶催化作用下煙葉上的蛋白質可以被水解為氨基酸等小分子物質，不但降解了蛋白質，且水解產物和進一步轉化的產物又可以產生煙草致香物質。蛋白酶來源即可購買商品酶也利用微生物發酵制備，但商品酶價格較高，這無形中增加了卷煙成本，而利用細菌發酵蛋白酶液操作方便且工藝簡單。

發明內容
本發明的目的是提供一株產蛋白酶的細菌菌株及利用細菌發酵蛋白酶液，使用經過濾除菌及超濾濃縮液作為改善低次等煙葉品質的方法。本發明的技術方案如下一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 0855-9菌株,菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2011年9月29日，該菌株分離自醇化煙葉，產蛋白酶能力較強。該0855-9菌株篩選培養基采用酪蛋白瓊脂培養基酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na2HP042g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，0. 4%溴麝香草酚藍溶液12. 5mL,pH7. 4，觀察水解圈產生情況，復篩采用福林-酚法測定蛋白酶的酶活。細菌發酵制備蛋白酶液具體步驟為①芽孢桿菌的活化和培養該芽孢桿菌的菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，經LB培養基活化后接入滅菌的種子培養基，于37°C、150rpm恒溫搖床培養12h，按I : 100的比例轉接于IL搖瓶中發酵60h制得發酵蛋白酶液；
②發酵蛋白酶液的加工發酵好的蛋白酶液經O. 22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液；以上所述的種子培養基及發酵培養基均是LB培養基，其主要組分為NaCl IOg,酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調節pH值至7.0，121°C高壓滅菌 20min。酶活性測定細菌發酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產生I μ g酪氨酸，定義為I個酶活力單位。使用制備的蛋白酶液作為改善低次等煙葉步驟是將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取一定量的煙絲，分為兩份；其中一份煙絲在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h ;然后于90°C條件下烘干30mins使酶失活，置于22°C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h ;以此煙絲為單一原料卷煙后進行評吸鑒定，另一份煙絲作 為該組比對參照物使用。本發明菌株發酵的蛋白酶液可以改善煙葉香氣質，雜氣減輕，質感、口感較好，煙葉品質明顯改善。煙草科技工作者研究表明煙葉上微生物所產酶能促進煙葉上大分子物質的轉化，有利于提高煙葉品質，所以利用分離自煙葉的產酶菌株發酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質有重要的研究價值，為利用細菌發酵酶液改善煙葉品質、提高煙葉可用性提供了一種途徑。


圖I :蛋白酶酶活測定標準曲線。
具體實施例方式本發明的發酵蛋白酶液來源產酶菌株是短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株，菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)。該菌株分離自醇化煙葉，產蛋白酶能力較強，能有效地改善煙葉品質。I、細菌發酵蛋白酶液的制備①芽孢桿菌的活化和培養該芽孢桿菌的菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，經LB培養基活化后接入滅菌的種子培養基，于37°C、150rpm恒溫搖床培養12h，按I : 100的比例轉接于IL搖瓶中發酵60h制得發酵蛋白酶液。以上所述的種子培養基及發酵培養基均是LB培養基，其主要組分為NaCl IOg,酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調節pH值至7.0，121°C高壓滅菌 20min。②發酵蛋白酶液的加工發酵好的蛋白酶液經O. 22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液。2、酶活性測定細菌發酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產生I μ g酪氨酸，定義為I個酶活力單位。3、改善低次等煙葉品質的方法
將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取一定量的煙絲，分為兩份。在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h ;然后于90°C條件下烘干30mins使酶失活，置于22°C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h ;以此煙絲為單一原料卷煙后進行評吸鑒定。實施例I :產蛋白酶菌株的篩選及鑒定短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 0855-9 菌株，菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，分離自優質品種紅大自然醇化煙葉上。菌株篩選培養基采用酪蛋白瓊脂培養基(酪蛋白IOg,牛肉膏3g, Na2HPO4 2g, NaCl 5g,瓊脂15g,蒸懼水1000mL,0. 4%溴磨香草酹藍溶液12. 5mL, pH7. 4)，觀察水解圈產生情況，復篩采用福林-酚法測定蛋白酶的酶活。利用16S rRNA基因的一對通用引物進行PCR擴增，連接載體轉化并進行測序，結果提交NCBI，通過BLAST進行序列同源性檢索分析，然后用CLUSTAL X軟件進行多序列比對并計算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性，采用鄰位相接法，應用M EGA4軟件構建系統進化樹。對該菌株進行測序分析，將其初步鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 0855-9 菌株，菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)。實施例2 :蛋白酶粗酶液的制備發酵蛋白酶來源為菌株保藏號為(CGMCC No. 5310)短小芽孢桿菌(Bacilluspumi lus) 0855-9菌株，經LB培養基活化后接入滅菌的種子培養基，于37 °C 150rpm恒溫搖床培養12h，按I : 100的比例轉接于IL搖瓶中發酵60h制得發酵蛋白酶液。以上所述的種子培養基及發酵培養基均是LB培養基，其主要組分為NaCl 10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調節pH值至7.0，121 °C高壓滅菌20min。發酵好的蛋白酶液經O. 22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液。細菌發酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產生Iyg酪氨酸，定義為I個酶活力單位。首先制備酪氨酸標準曲線(圖I)，然后將含有蛋白酶的發酵液用pH7. 2,50mmol/L的磷酸鹽緩沖液經適當的稀釋后，取稀釋的酶液IOOul在37°C下保溫2min，加入2%干酪素lOOul，37 °C下保溫IOmin后，加入O. 4mol/L的三氯乙酸終止反應,繼續保溫15min使殘余蛋白沉淀完全，13000rpm離心Imin,取上清液lOOul，然后加入0. 4mol/L的碳酸鈉500ul，福林酚試劑IOOul混勻后，于37°C發色IOmin,用分光光度計測定660nm處的吸光值。同時做一份空白對照，唯在添加2%干酪素之前先加三氯乙酸使酶失活，測定660nm處的吸光值。實施例3 :蛋白酶粗酶液改善低次等煙葉品質的方法將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取50克的煙絲，分為兩份。在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，0855-9發酵酶液的施酶量為48U/g煙葉，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h，然后于90°C條件下烘干30min使酶失活，置于22 °C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h。以平衡好的煙絲為單一原料卷煙后進行評吸鑒定，由紅塔集團技術中心評吸員完成評吸，采用《玉溪優質烤煙單料煙感官質量評吸方法》(云南省地方標準，標準編號DB53/T182. 3-2006)(表 I)。從評析結果可以看出(表2):對照煙氣濃度較高，雜氣顯，回味稍差，酸、澀，略有毛刺感，質粗糙；LB發酵培養基對煙葉感官質量無不良影響，也沒有改善煙葉品質，所以LB發酵培養基不影響蛋白酶液處理煙葉的結果。評吸結果表明，該菌株發酵的蛋白酶液對煙葉品質的改善較為明顯，表現為香氣質改善，雜氣減輕，質感、口感均較好，勁頭略有下降，刺激性有所改善。表I :紅塔集團單體煙葉感觀質量評價方法及指標
權利要求
1.一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumi lus) 0855-9菌株，菌株保藏號是(CGMCCNo. 5310)，該菌株分離自醇化煙葉，產蛋白酶能力較強。
2.根據權利要求I所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus),其特征在于該0855-9菌株篩選培養基采用酪蛋白瓊脂培養基酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na2HPO4 2g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，0. 4%溴麝香草酚藍溶液12. 5mL, pH7. 4，觀察水解圈產生情況，復篩采用福林-酚法測定蛋白酶的酶活。
3.使用權利要求I所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液的方法，其特征在于細菌發酵制備蛋白酶液具體步驟為 ①芽孢桿菌的活化和培養該芽孢桿菌的菌株保藏號是(CGMCCNo. 5310)，經LB培養基活化后接入滅菌的種子培養基，于37°C、150rpm恒溫搖床培養12h，按I : 100的比例轉接于IL搖瓶中發酵60h制得發酵蛋白酶液； ②發酵蛋白酶液的加工發酵好的蛋白酶液經O.22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液； 以上所述的種子培養基及發酵培養基均是LB培養基，其主要組分為NaCl 10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調節pH值至7.0，121 °C高壓滅菌20mino
4.根據權利要求3所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液，其特征在于酶活性測定細菌發酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產生I μ g酪氨酸，定義為I個酶活力單位。
5.根據權利要求3所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液，其特征在于使用制備的蛋白酶液作為改善低次等煙葉步驟是 將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取一定量的煙絲，分為兩份；其中一份煙絲在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h ;然后于90°C條件下烘干30mins使酶失活，置于22°C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h ;以此煙絲為單一原料卷煙后進行評吸鑒定，另一份煙絲作為該組比對參照物使用。
全文摘要
本發明公開了一種利用細菌發酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質的方法。按以下步驟進行1)細菌發酵蛋白酶液的制備①產蛋白酶的芽孢桿菌菌種經LB培養基活化后接入滅菌的種子培養基，于37℃、150rpm恒溫搖床培養12h，按1∶100的比例轉接于1L搖瓶中發酵60h制得發酵蛋白酶液；②發酵蛋白酶液的加工發酵好的蛋白酶液經0.22μm中空纖維管過濾除菌，10000MWCO超濾濃縮制得粗酶液；2)改善低次等煙葉品質粗酶液按一定2％的比例均勻地噴施于煙絲，置于自封袋中室溫下作用12h，90℃、30min使酶失活，置于22℃，相對濕度55％的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h。感官評吸結果顯示，此菌株發酵的蛋白酶液可以改善煙葉香氣質，雜氣減輕，質感、口感較好，煙葉品質明顯改善。
文檔編號A24B15/20GK102816710SQ20111043552
公開日2012年12月12日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者王毅, 魏云林, 馬永凱, 唐興宏, 季秀玲, 于會喜, 吳瀟 申請人:紅塔煙草(集團)有限責任公司